Ввг п расшифровка: Кабель ВВГ-П — Расшифровка, Характеристики и все Сечения

Содержание

Кабель ВВГ п | Кабель ВВГ, ВВГнг, ВВГНГ-ls

Кабель ВВГ п (он же – силовой провод ВВГ п), традиционно применяется в стационарных установках, имеющих номинальное напряжение 0,6 и 1 кВ, а также частоту электротока, которая равняется 50 Гц. От прочих подвидов кабеля ВВГ он отличается тем, что его жилы (которых может быть от одной до пяти) находятся в одной плоскости и имеют плоскую форму.

Расшифровка кабеля ВВГ П

Расшифровка ВВГ п очень проста – «винил-винил-голый плоский». Первые два слова обозначают  использование поливинилхлорида в изоляции и в оболочке. Третье слово обозначает, что защитного слоя у данного кабеля не имеется.  Ну а последнее слово относится к форм-фактору, который является крайне удобным во многих ситуациях, когда круглая форма жил может стать причиной затруднений – например, когда компактность размещения кабеля играет первостепенную роль. Так что в некоторых ситуациях применение ВВГ п может быть более выигрышным.

Важно отметить, что в маркировке отсутствует буква «А», что значит, что данный кабель непременно будет медный.

Техническое описание провода ВВГ П

Как и прочие виды ВВГ, ВВГ п может иметь одну жилу, либо несколько. В зависимости от этого могут варьироваться многие параметры кабеля. Например, минимальным номинальным сечением у одножильного кабеля, как правило, является 2,5 мм2, в то время как у многожильного обычно это 70 мм2. Это относится к токоведущим жилам, потому что сечения жил в многожильном кабеле могут отличаться. Допустимый ток также напрямую зависит от количества жил, а также от того, размещается кабель на воздухе или же в земле (хотя в земле без защиты прокладывать такой кабель не рекомендуется). В зависимости от этого допустимый ток колеблется в значительной мере. Минимальным значением, как правило, является 21 А.

Минимальный наружный диаметр равняется 4,98 мм, в дальнейшем он увеличивается по мере того как увеличивается площадь сечения кабеля.

Пропорциональна сечению и масса, которая, обычно, изменяется в килограммах на один километр. При двух жилах, имеющих площадь 1,5 мм2, она равняется примерно 67,71 кг/км, если таких жил будет три – то 96,79 кг/км и так далее – вплоть до сотен килограмм.

Если вы решите купить подобный кабель, непременно прочтите внимательно его описание, убедитесь, что его габариты и характеристики в точности соответствуют тем задачам, что вы собираетесь решить. Также от этого будет зависеть цена – логично предполагать, что более крупный кабель будет иметь большую стоимость, потому не упускайте возможность прочитать описание.  Ну а срок службы такого кабеля составляет от тридцати лет и более, из которых гарантийными традиционно являются пять.

Другие разновидности провода ВВГ:

Кабель ВВГ, ВВГнг, ВВГнгд, ВВГп: расшифровка, характеристики, применение

Автор zamolotkom.ru На чтение 3 мин. Просмотров 207 Опубликовано

05.06.2020

Кабель ВВГ широко распространен, и используется для распределения и передачи электрической энергии. Большое количество разновидностей проводника и его надежность делают его еще более популярным. Подходит для работы под напряжением до 1000 вольт на частоте 50 Гц. Именно его монтируют в условиях повышенной влажности, риска возгорания и на открытых территориях. Качественный кабель подходит для прокладывания в бытовых и промышленных условиях.

Особенности

Проводники в кабеле ВВГ изготовлены из меди, жилы оснащены поливинилхлоридной изоляцией. Он не защищен и также изолирован поливинилхлоридом. Максимальное возможное количество жил в нем – 5, каждая из них должна быть изолирована. В ситуации, когда проводников в кабеле несколько, каждый имеет обозначение цветом.

  • “Фаза” может быть любого цвета.
  • “Заземление” чаще всего желтое с зеленым оформлением.
  • “Ноль” – синий с белым оформлением.

Какие кабели ВВНГ можно купить в Pro100Kabel?

По стандарту силовой кабель имеет обозначение ВВГ. Дополнительные буквы в обозначении говорят о специализированной модификации. Аббревиатура ВВГнг говорит о том, что он является негорючим. ВВГнг подходит для монтажа в местах, где существует высокая вероятность воспламенения. Некоторые разновидности кабеля выражены в дополнительных символах в буквенном обозначении.

ВВГнг-LS

Кабель ВВГнг LS подразумевает наличие изоляции, что позволяет минимизировать задымление при возникновении возгорания.

ВВГнг-LSLTx

ВВГнг-LSLTx оснащен изоляцией из пластификата, который не образует дыма при воспламенении. Процесс горения изоляционный материал также не поддерживает. Данный проводник сохраняет работу даже во время возгорания, что является его отличительной чертой. Этот тип используют для прокладывания линий постоянного и переменного тока.

ВВГп

Плоский проводник, который не поддерживает горение в случае одиночной прокладки.

ВВГнг-HF

Проводник ВВГнг-HF оснащен оболочкой из пластика с низким содержанием хлора. В случае воспламенения он источает не слишком большое количество отравляющих веществ.

ВВГнг-FRLS

Особенностью этого проводника является его усиленная защита в виде двух лент. В составе усиления есть слюда, за счет чего он обладает повышенной прочностью. Кабель этого типа способны сохранять целостность даже после взрыва.

ВВГнгд

Конструкция состоит из медных токопроводящих жил, каждая оснащена поливинилхлоридной изоляцией. Образует мало дыма при возгорании, плохо поддерживает горение. Подходит для монтажа в стационарных установках, номинальным напряжением 660В и 1000В с частотой 50Гц. Подходит для монтажа в сухих и влажных помещениях.

Ключевые характеристики

  • Продолжает функционировать при перегрузе (до +90 градусов Цельсия), замыкании (до +150-+250 градусов), спокойном состоянии до +70 градусов.
  • Противостоит огню на протяжении 90 минут.
  • Производить монтаж кабеля можно при температуре до -15 градусов Цельсия.
  • Допустимая температура для эксплуатации от -50 до +50 градусов.

Источник

Расшифровка сокращений марок кабеля и провода — Simple Cable Company

Для удобства Вашей работы предлагаем Вам список аббревиатур различных марок кабеля и провода.
Сразу хотим заметить, что единой буквенно-цифровой системы обозначения кабельных изделий не установлено. Существует гостированное техническое обозначение материалов, из которых состоят элементы изделий, а также их конструктивных особенностей.

Значение аббревиатур марок кабеля и провода отечественного производства:

 

Расшифровка сокращений, применяемых для обозначений силовых кабелей с ПВХ (виниловой) и резиновой изоляцией (по ГОСТ 16442-80, ТУ16.71-277-98, ТУ 16.К71-335-2004)

А — (первая буква) алюминиевая жила, при ее отсутствии — жила медная по умолчанию (АСБл; ААБл; АВВГ).
АС — Алюминиевая жила и свинцовая оболочка (АС; ААБл).
АА — Алюминиевая жила и алюминиевая оболочка (ААШв; ААБл).

Б — Броня из двух стальных лент с антикоррозийным защитным покровом (АВБбШв; ВБбШв).
Бн — То же, но с негорючим защитным покровом (не поддерживающим горение).
б – Без подушки (АВБбШв; ВБбШв).
В — (первая (при отсутствии А) буква) ПВХ изоляция (ВВГ; ВБбШв).
В — (вторая (при отсутствии А) буква) ПВХ оболочка (ВВГ; ВВГнгд).
Г — В начале обозначения — кабель предназначен для горных выработок, в конце обозначения — отсутствие защитного покрова поверх брони или оболочки («голый») (МГ).
г — Водоблокирующие ленты герметизации металлического экрана (в конце обозначения).
2г — Алюмополимерная лента поверх герметизированного экрана .
Шв — Защитный покров в виде выпрессованного шланга (оболочки) из поливинилхлорида (АВБбШв; ВБбШв).
Шп — Защитный покров в виде выпрессованного шланга (оболочки) из полиэтилена.
Шпс – Защитный покров из выпрессованного шланга из самозатухающего полиэтилена.
К – Броня из круглых оцинкованных стальных проволок, поверх которых наложен защитный покров. Если стоит в начале обозначения – контрольный кабель (КВВГ; КВБбШв).
С – Свинцовая оболочка.
О — Отдельные оболочки поверх каждой фазы.
Р – Резиновая изоляция.
НР — Резиновая изоляция и оболочка из резины, не поддерживающей горение.
П — Изоляция или оболочка из термопластичного полиэтилена.
Пс — Изоляция или оболочка из самозатухающего полиэтилена (не поддерживающего горение).
Пв — Изоляция из вулканизированного полиэтилена.
БбГ — Броня профилированной стальной ленты.
нг — Не поддерживающий горения (ВВГнг; СИП-5нг).
LS — Low Smoke — низкое дымо- и газовыделение (АВВГнг-LS-HF; ВВГнг-LS-HF).
КГ — Кабель гибкий (КГ).

Кабель с БПИ — бумажной пропитанной изоляцией ( по ГОСТ 18410-73):

А — (первая буква) алюминиевая жила, при ее отсутствии — жила медная по умолчанию. Если в середине обозначения после символа материала жилы, то алюминиевая оболочка.
Б – Броня из плоских стальных лент (после символа материала оболочки).
АБ — Алюминиевая броня (ААБл).

СБ — (первая или вторая (после А) буква) свинцовая броня (АСБл).
С – Материал оболочки свинец.
О – Отдельно освинцованная жила.
П — Броня из плоских стальных оцинкованных проволок.
К — Броня из круглых стальных оцинкованных проволок.
В – Изоляция бумажная с обедненной пропиткой. Ставится в конце обозначения через тире.
б – Без подушки.
л — В составе подушки дополнительная 1 лавсановая лента.
2л — В составе подушки дополнительная двойная лавсановая лента.
Г — Отсутствие защитного покрова («голый»).
н – Негорючий наружный покров. Ставится после символа брони.
Шв — Наружный покров в виде выпрессованного шланга (оболочки) из поливинилхлорида.
Шп – Наружный покров в виде выпрессованного шланга (оболочки) из полиэтилена.
Швпг – Наружный покров из выпрессованного шланга из поливинилхлорида пониженной горючести.
(ож) – Кабели с однопроволочными жилами. Ставится в конце обозначения.
У — Изоляция бумажная с повышенной температурой нагрева. Ставится в конце обозначения.
Ц – Бумажная изоляция, пропитанная нестекающим составом. Ставится впереди обозначения.

Контрольный кабель (по ГОСТ 1508-78):

А — (первая буква) алюминиевая жила, при ее отсутствии — жила медная по умолчанию.
В — (вторая (при отсутствии А) буква) ПВХ изоляция.
В — (третья (при отсутствии А) буква) ПВХ оболочка.
П — Изоляция из полиэтилена.
Пс — Изоляция из самозатухающего полиэтилена.
Г — Отсутствие защитного покрова («голый»).
Р – Резиновая изоляция.
К — (первая или вторая (после А) буква) — кабель контрольный (КГЭШв, КВВГ, КВБбШв).
Kроме КГ — кабель гибкий.
Ф – Изоляция из фторопласта.
Э – В начале обозначения – кабель силовой для особо шахтных условий , в середине или в конце обозначения — кабель экранированный.

Подвесные провода:

А — Алюминиевый голый провод (А).
АС — Алюминиево-Стальной (чаще употребляется слово «сталеалюминевый») голый провод (АС).
СИП — Самонесущий Изолированный Провод (СИП-4; СИП-5).

СИПнг — Самонесущий Изолированный Провод, не поддерживающий горение (СИП-5нг).

Силовые, установочные провода и шнуры соединительные:

Марку провода и шнура записывают в виде сочетания букв и цифр:
А — Алюминий, отсутствие в марке провода буквы А означает, что токоведущая жила из меди.
П (или Ш) – вторая буква, обозначает провод (или шнур).
Р – Резиновая изоляция.
В – Изоляция из поливинилхлорида.
П – Полиэтиленовая изоляция.
Н – Изоляция из наиритовой резины.
Число жил и сечение указывают следующим образом: ставят черточку; записывают число жил; ставят знак умножение; записывают сечение жилы.
В марках проводов и шнуров могут быть и другие буквы, характеризующие другие элементы конструкции:
Д — Провод двойной.
О — Оплетка.
Т — Для прокладки в трубах.
П — Плоский с разделительным основанием.
Г — Гибкий.

Монтажные провода:

М – Монтажный провод (ставится в начале обозначения).
Г — Многопроволочная жила (отсутствие буквы указывает на то, что жила однопроволочная).
Ш — Изоляция из полиамидного шелка.
Ц — Изоляция пленочная.
В — Поливинилхлоридная изоляция.
К — Капроновая изоляция.
Л – Лакированный.
С — Обмотка и оплетка из стекловолокна.
Д — Двойная оплетка.
О — Оплетка из полиамидного шелка.
Э – Экранированный.
МЭ — Эмалированный.

Расшифровка некоторых особых аббревиатур:

КСПВ — Кабели для Систем Передачи в Виниловой оболочке.
КПСВВ — Кабели Пожарной Сигнализации, с Виниловой изоляцией, в Виниловой оболочке.
КПСВЭВ — Кабели Пожарной Сигнализации, с Виниловой изоляцией, с Экраном, в Виниловой оболочке.
ПНСВ — Провод Нагревательный, Стальная жила, Виниловая оболочка.
ПВ-1, ПВ-3 — Провод с Виниловой изоляцией. 1, 3 — класс гибкости жилы (ПВ-1; ПВ-3).
ПВС — Провод в Виниловой оболочке Соединительный (ПВС).
ШВВП — Шнур с Виниловой изоляцией, в Виниловой оболочке, Плоский (ШВВП).
ПУНП — Провод Универсальный Плоский.
ПУГНП — Провод Универсальный Плоский Гибкий.

Значение аббревиатур марок кабеля и провода зарубежного производства:

 

Силовой кабель:

N – Обозначает что кабель изготовлен согласно немецкому стандарту VDE ( Verband Deutscher Elektrotechniker — Союз германских электротехников).
Y – Материал изготовления изоляции ПВХ (YnKY).
H — Указывает на отсутствие в ПВХ изоляции галогенов ( вредных органических соединений) (N2XH).
M — Указывает на назначение кабеля — монтажный.
C – Наличие медного экрана.
RG – Наличие брони.

FROR

— кабель итальянского производства, имеет специфические обозначения согласно итальянскому стандарту CEI UNEL 35011:
F — corda flessibile — гибкая жила.
R — polivinilclorudo — PVC — ПВХ изоляция
O — anime riunite per cavo rotondo — круглый, не плоский кабель.
R — polivinilclorudo — PVC — ПВХ оболочка.

Контрольный кабель:

Y – ПВХ изоляция (YnKY).
SL — Кабель контрольный.
Li — Многожильный проводник по немецкому стандарту VDE (см.выше).

Безгалогеновый огнестойкий кабель:

N — Изготовлен согласно немецкому стандарту VDE (см.выше).
HX – Изоляция из сшитой резины.
C — Медный экран.
FE 180 — Целостность изоляции, при использовании кабеля без крепежной системы, при пожаре сохраняется на протяжении 180 минут (FLAME-X 950 (N)HXH FE180/E30).
E 90 — Работоспособность кабеля в случае пожара при прокладке вместе с крепежной системой, сохраняется на протяжении 90 минут (FLAME-X 950 (N)HXH FE180/E90).

Провода монтажные:

H — Гармонизированный провод (одобрение HAR).
N — Соответствие национальному стандарту.
05 -Номинальное напряжение 300/500 В.
07 — Номинальное напряжение 450/750 В.
V — ПВХ изоляция.
K – Гибкая жила для стационарного монтажа.

Кабели с изоляцией из сшитого полиэтилена:

N – Изготовлен согласно немецкому стандарту VDE (см.выше).
Y – ПВХ изоляция (YnKY).
2Y – Изоляция из полиэтилена.
2X – Изоляция из сшитого полиэтилена.
S — Медный экран.
(F) — Продольная герметизация.
(FL) — Продольная и поперечная герметизация.
E — Трехжильный кабель.
R — Броня из круглых стальных проволок.

Примеры расшифровки сокращений марок кабеля и провода:

СИП-5 — Самонесущий Изолированный Провод (СИП-4; СИП-5).
СИП-5нг — Самонесущий Изолированный Провод, не поддерживающий горение (СИП-5нг).

Принципиальное отличие «ВВГ» от «ВВГ-п»

Силовые провода типа ВВГ (ВВГ-п) применяются в устройствах стационарного типа. Они используются для обеспечения передачи и (или) распределения электроэнергии.

Продукция  данного вида может применяться для обустройства кабельных  линий в воздушном пространстве при отсутствии угрозы повреждения провода, а также может использоваться для исполнения различных кабельных силовых линий, как в сухих, так и сырых помещениях, шахтах, каналах, тоннелях, коллекторах и прочих производственных помещениях. Специфические условия исполнения обеспечивают их эксплуатацию в помещениях с явной опасностью затопления, с признаками коррозионной активности, взрывоопасных, а также пожароопасных зонах. Монтаж линий может осуществляться в любой плоскости.

Все для сада: шланги xhose недорого в Москве

Конструкция

Конструктивно все кабели данного типа изготавливаются на базе медных однопроволочных токопроводящих жил, как правило, круглого сечения,  которые заключены в специальную изоляцию. Единичные изолированные жилы укладываются в параллельных плоскостях и закрываются оболочкой из половинилхродного пластиката.

Кабели ВВГ-п являются одной из разновидностей проводов типа ВВГ. Главное их отличие заключается в конструкции исполнения.

Принципиальное отличие

Принципиальное отличие кабелей ВВГ-п (плоские) от ВВГ определяется следующим:

  • Плоскость укладки жил. Токопроводящие жилы ВВГ уложены в параллельные плоскости и заключены в изолирующую конструкцию круглой формы. А изолированные жилы проводов ВВГ-п  исполнены в одной плоскости и заключены в плоскую изолирующую конструкцию. Символ «п» и обозначает —  плоскую форму.
  • Количество токопроводящих жил. В кабеле ВВГ-п, как правило, количество жил ограничено тремя единицами, в то время как в ВВГ, количество жил может выполнено в количестве  до шести штук.
  • Сечение жил. Конструктивно провода ВВГ-п изготавливаются из жил единого сечения, как правило, круглой формы. В то время как токопроводящие жилы ВВГ могут выполняться как круглого сечения, так и сегментного сечения. В многожильных проводах ВВГ могут быть установлены жилы различного сечения. К примеру, трехжильный провод может включать в себя одну жилу меньшего диаметра (заземление или ноль).

Особенности применения ВВГ-п

Таким образом, кабель ВВГ-п в силу своего специфического конструктивного исполнения имеет более узкий спектр применения.  Величина номинального сечения жил может равняться не более 16 квадратных миллиметров включительно. Они используются для исполнения линий питания как в сухих, так в помещениях с повышенной влажностью, на кабельных эстакадах, Кроме этого, они применяются для обустройства кабельных трасс на открытых участках, подверженных воздействию атмосферных явлений. Они устойчивы к распространению горения при условии одиночной прокладки, а кабеля ВВГ-п с маркировкой «НГ» также устойчивы к распространению горения в условиях пучковой прокладки. Провод ВВГ-п не рассчитан на использование в кабельных трассах, которые расположены в траншеях (в земле).

Изоляция жил выполнена в разноцветных тонах. К примеру, нулевые жилы облачены в изоляцию светло – синего (голубого) оттенка, которая также может иметь соответствующие цифровые обозначения. А жилы заземления исполнены с двухцветной изоляцией (желто-зеленого оттенка) и обозначаются цифрой «0».

Диапазон эксплуатационных температур кабеля: — 50 °С  …. +50 °С. Провода устойчивы к воздействию повышенной влажности равной 98% в окружающей среде с температурой около +35 °С.

Номинальное сопротивление изоляции составляет 12 Мом при сечении жилы 1,5 кв. мм, 10 Мом – при 2-4 кв. мм, 9 Мом – при 6 кв. мм и 7 Мом – при 10 кв. мм. Данные показатели рассчитаны на длину кабеля равную 1 км при температуре +20 °С.

Отличие данных кабелей необходимо понимать также при разработке дизайна интерьера квартир, поскольку геометрия кабеля сильно влияет на внешний вид места проводки, а соответственно, и на весь дизайн интерьера квартиры. Для многих дизайн квартиры очень важен, поэтому чем отличается самый популярный кабель для проводки в квартире лучше знать каждому.

.

ВВГ-П 3х1,5 — все технические характеристики силового медного кабеля

Кабели ВВГ других конструкций смотрите здесь!

Кабель марки ВВГ-П 3х1,5 является силовым медножильным кабелем, который часто используется в ремонтных и строительных работах. В соответствии с требованиями действующих норм и правил, применение кабеля ВВГ невозможно внутри зданий. Такое ограничение введено с целью повышения пожарной безопасности жилых и нежилых помещений.

Характеристики кабеля ВВГ-П 3х1,5
по ГОСТ 31996-2012

Кабель ВВГ-П 3х1,5 имеет поливинилхлоридный изоляционный слой и наружную оболочку и применяется для цепей, соответствующих следующим условиям:

  • напряжение сети не более 1000 В;
  • частота сети не более 50 Гц.

Расшифровка обозначения кабеля ВВГ-П 3х1,5

  • В — «винил», изоляция выполнена из пластиката поливинилхлорида;
  • В — «винил», оболочка выполнена из пластиката поливинилхлорида;
  • Г — «голый», в кабеле отсутствует броня;
  • П (при наличии) — плоская конструкция кабеля;
  • 3 — количество жил;
  • 1.5 — площадь сечение одной медной жилы, мм2.

Основные технические характеристики кабеля ВВГ-П 3х1,5

Все характеристики кабеля, необходимые для заказа и расчета, мы представили в виде таблицы.

Наименование характеристикиЕд. изм.Значение
ГОСТ—ГОСТ 31996-2012
Класс жилы по ГОСТ 22483-2012—1
Код ОКП—35 2122; 35 3371
Класс пожарной опасности—О1.8.2.5.4
Диапазон температур эксплуатации°Сот -50 до 50
Минимальная температура монтажа°С-15
Продолжительность эксплуатациилет30
Напряжение сетиВдо 1000
Частота переменного тока в сетиГц50 Гц
Допустимое растягивающее усилиеН135
Максимально допустимая температура нагрева жил при КЗ°С160
Продолжительность короткого замыкания, не болеес5
Расчетная масса (вес) кабеля, 0,66 кВкг/км131
Расчетная масса (вес) одного метра кабеля, 0,66 кВкг/м131/1000
Расчетная масса (вес) кабеля, 1 кВкг/км150
Расчетная масса (вес) одного метра кабеля, 1 кВкг/м150/1000
Допустимый радиус изгибамм102
Допустимая токовая нагрузка при прокладке на воздухеА21
Допустимая токовая нагрузка при прокладке в землеА27
Допустимый ток односекундного короткого замыканияА0.17
Объем горючей массыл/км114
Сопротивление изоляции жилМОм/км12
Толщина изоляции жил, 1 кВмм0.8
Толщина изоляции жил, 0,66 кВмм0.6
Масса цветного металлаг/м40.05
Максимальная мощность при прокладке в воздухе, 220 ВкВттребует уточнения
Максимальная мощность при прокладке в земле, 220 ВкВттребует уточнения
Максимальная мощность при прокладке в воздухе, 380 ВкВттребует уточнения
Максимальная мощность при прокладке в земле, 380 ВкВттребует уточнения
Температура нагрева жил по условию невозгорания°С350
Длительно допустимая температура нагрева жил°С70
Допустимая температура в режиме перегрузки°С90
Электрическое сопротивление жилыОм/км12.1

Мнение эксперта

Главный редактор LinijaOpory

Александр Новиков — основной автор и вдохновитель нашего сайта. Автор схем и чертежей.

Перед проведением расчетов мы рекомендуем вам дополнительно запросить характеристики кабеля на заводе-изготовителе!

Конструктивные особенности ВВГ-П 3х1,5

В представленной ниже таблице отражены особенности конструкции кабеля.

Наименование характеристикиЕд. изм.Значение
Количество жилшт.3
Максимальный диаметр жилымм1.5
Наружный диаметр кабеля, 0,66кВмм9.4
Наружный диаметр кабеля, 1 кВмм10.2
Максимальный вескг/м0.131
Материал жилы—Медь
Материал изоляции—ПВХ
Материал оболочки—ПВХ
Тип конструкции жилы—требует уточнения

Варианты конструкции жил:

  • ок — однопроволочная жила;
  • мк — многопроволочная жила.

Скачать чертеж кабеля ВВГ-П 3х1,5 в формате DWG (Autocad)

Если вы хотите скачать чертеж сечения и проекции кабеля ВВГ-П 3х1,5 в редактируемом формате программы Autocad, напишите нам!

ᐉ Как расшифровать маркировку провода — расшифровка отечественных обозначений, применяемых для обозначений силовых кабелей с ПВХ

11.07.2019

Расшифровка отечественных

 обозначений, применяемых для обозначений силовых кабелей с ПВХ (виниловой) и резиновой изоляцией (по ГОСТ 16442-80, ТУ16.71-277-98, ТУ 16.К71-335-2004)
  • А — (первая буква) алюминиевая жила, при ее отсутствии — жила медная по умолчанию (АСБл; ААБл; АВВГ).
  • АС — Алюминиевая жила и свинцовая оболочка (АС; ААБл).
  • АА — Алюминиевая жила и алюминиевая оболочка (ААШв; ААБл).
  • Б — Броня из двух стальных лент с антикоррозийным защитным покровом (АВБШв; ВВБШв).
  • Бн — То же, но с негорючим защитным покровом (не поддерживающим горение).
  • б – Без подушки (АВВБШв; ВВБШв).
  • В — (первая (при отсутствии А) буква) ПВХ изоляция (ВВГ; ВВБШв).
  • В — (вторая (при отсутствии А) буква) ПВХ оболочка (ВВГ; ВВГнгд).
  • Г — В начале обозначения — кабель предназначен для горных выработок, в конце обозначения — отсутствие защитного покрова поверх брони или оболочки («голый») (МГ).
  • г — Водоблокирующие ленты герметизации металлического экрана (в конце обозначения).
  • 2г — Алюмополимерная лента поверх герметизированного экрана.
  • Шв —Защитный покров в виде выпрессованного шланга (оболочки) из поливинилхлорида (АВВБШв; ВВбШВ).
  • Шп —Защитный покров в виде выпрессованного шланга (оболочки) из полиэтилена.
  • Шпс -Защитный покров из выпрессованного шланга из самозатухающего полиэтилена.
  • К – Броня из круглых оцинкованных стальных проволок, поверх которых наложен защитный покров. Если стоит в начале обозначения – контрольный кабель (КВВГ; КВБбШв).
  • С – Свинцовая оболочка.
  • О —Отдельные оболочки поверх каждой фазы.
  • Р – Резиновая изоляция.
  • НР — Резиновая изоляция и оболочка из резины, не поддерживающей горение.
  • П — Изоляция или оболочка из термопластичного полиэтилена.
  • Пс — Изоляция или оболочка из самозатухающего полиэтилена (не поддерживающего горение).
  • Пв — Изоляция из вулканизированного полиэтилена.
  • БбГ Броня профилированной стальной ленты.
  • нг — Не поддерживающий горения (ВВГнг; СИП5нг)
  • нгд-Низкое низкое дымо-газовыделение (АВВГнгд; ВВГнгд)
  • LS — Low Smoke — низкое дымо-газовыделение (АВВГнг-LS-HF; ВВГнг-LS-HF).
  • КГ — Кабель гибкий (КГ).

Кабель с БПИ — бумажной пропитанной изоляцией ( по ГОСТ 18410-73)

  • А — (первая буква) алюминиевая жила, при ее отсутствии — жила медная. Если в середине обозначения после символа материала жилы, то алюминиевая оболочка.
  • Б – Броня из плоских стальных лент (после символа материала оболочки).
  • АБ — Алюминиевая броня (ААБл).
  • СБ — (первая или вторая (после А) буква) свинцовая броня (АСБл).
  • С – Материал оболочки свинец.
  • О – Отдельно освинцованная жила.
  • П — Броня из плоских стальных оцинкованных проволок.
  • К — Броня из круглых стальных оцинкованных проволок.
  • В – Изоляция бумажная с обедненной пропиткой. Ставится в конце обозначения через тире.
  • б – Без подушки.
  • л — В составе подушки дополнительная 1 лавсановая лента.
  • 2л —В составе подушки дополнительная двойная лавсановая лента.
  • Г — Отсутствие защитного покрова («голый»).
  • н – Негорючий наружный покров. Ставится после символа брони.
  • Шв —Наружный покров в виде выпрессованного шланга (оболочки) из поливинилхлорида.
  • Шп – Наружный покров в виде выпрессованного шланга (оболочки) из полиэтилена.
  • Швпг –Наружный покров из выпрессованного шланга из поливинилхлорида пониженной горючести.
  • (ож) – Кабели с монолитными жилами. Ставится в конце обозначения.
  • У — Изоляция бумажная с повышенной температурой нагрева. Ставится в конце обозначения.
  • Ц – Бумажная изоляция, пропитанная нестекающим составом. Ставится впереди обозначения.

Контрольный кабель (по ГОСТ 1508-78)

  • А — (первая буква) алюминиевая жила, при ее отсутствии — жила медная.
  • В — (вторая (при отсутствии А) буква) ПВХ изоляция.
  • В — (третья (при отсутствии А) буква) ПВХ оболочка.
  • П — Изоляция из полиэтилена.
  • Пс — Изоляция из самозатухающего полиэтилена.
  • Г — Отсутствие защитного покрова («голый»).
  • Р – Резиновая изоляция.
  • К — (первая или вторая (после А) буква) — кабель контрольный (КГЭШв, КВВГ, КВБбШв).
  • кроме КГ — кабель гибкий.
  • Ф – Изоляция из фторопласта.
  • Э – В начале обозначения – кабель силовой для особо шахтных условий, в середине или в конце обозначения — кабель экранированный.

Провода для воздушных линий:

  • А — Алюминиевый голый провод (А).
  • АС — Алюминиево-Стальной )голый провод (АС).
  • СИП — Самонесущий Изолированный Провод (СИП-4; СИП-5).
  • СИПнг — Самонесущий Изолированный Провод, не поддерживающий горение (СИП5 нг).

Силовые, установочные провода и шнуры соединительные

  • А — Алюминий, отсутствие в марке провода буквы А означает, что токоведущая жила из меди.
  • П (или Ш) – вторая буква, обозначает провод (или шнур).
  • Р – Резиновая изоляция.
  • В – Изоляция из поливинилхлорида.
  • П – Полиэтиленовая изоляция.
  • Н – Изоляция из наиритовой резины.
  • Число жил и сечение указывают следующим образом: записывают число жил; ставят знак умножение; записывают сечение жилы.
  • В марках проводов и шнуров могут быть и другие буквы, характеризующие другие элементы конструкции:
  • Д — Провод двойной.
  • О — Оплетка.
  • Т — Для прокладки в трубах.
  • П — Плоский с разделительным основанием.
  • Г — Гибкий.

Монтажные провода:

  • М – Монтажный провод (ставится в начале обозначения).
  • Г — Многопроволочная жила (отсутствие буквы указывает на то, что жила однопроволочная).
  • Ш — Изоляция из полиамидного шелка.
  • Ц — Изоляция пленочная.
  • В — Поливинилхлоридная изоляция.
  • К — Капроновая изоляция.
  • Л – Лакированный.
  • С — Обмотка и оплетка из стекловолокна.
  • Д — Двойная оплетка.
  • О — Оплетка из полиамидного шелка.
  • Э – Экранированный.
  • МЭ — Эмалированный.

Расшифровка некоторых особых аббревиатур:

  • КСПВ — Кабели для Систем Передачи в Виниловой оболочке.
  • КПСВВ — Кабели Пожарной Сигнализации, с Виниловой изоляцией, в Виниловой оболочке.
  • КПСВЭВ — Кабели Пожарной Сигнализации, с Виниловой изоляцией, с Экраном, в Виниловой оболочке.
  • ПНСВ — Провод Нагревательный( используется для прогрева бетона), Стальная жила, Виниловая оболочка.
  • ПВ-1, ПВ-3 — Провод с Виниловой изоляцией. 1, 3 — класс гибкости жилы (ПВ-1; ПВ-З).
  • ПВС — Провод в Виниловой оболочке Соединительный (ПВС).
  • ШВВП — Шнур с Виниловой изоляцией, в Виниловой оболочке, Плоский (ШВВП).
  • ПУНП — Провод Универсальный Плоский.
  • ПУГНП — Провод Универсальный Плоский Гибкий.

Силовой кабель ВВГнг-П — цены, прайс-лист 2021

 

Расшифровка аббревиатуры кабеля ВВГнг-П

  • В — означает, то что изоляция кабельных жил из ПВХ
  • В — означает то, что покрытие оболочки сердечника выполнено из ПВХ-пластиката
  • Г- указывает на то, что кабель не имеет защитной оболочки («голый»)
  • нг- дополнительная маркировка говорящая о том, что пластикат изоляции пониженной горючести
  • П — означает что кабельные жилы уложены в одной плоскости
  • ож — означает, что жилы кабеля однопроволочные

Характеристики и условия эксплуатации кабеля ВВГнг-П

Этот вид кабеля применяется для передачи и распределения электроэнергии номинальным напряжением от 600В до 1000В с частотой 50Гц. Модификация ВВГ, ВВГнг-П — это не распространяющий горение при прокладке пучками, плоский кабель.

Как и все кабели марки ВВГ, ВВГнг-П устойчив к высокой температуре и может эксплуатировать в диапазоне от -50о до +50о и в условиях высокой влажности – до 98%. Нагрев такого кабеля в течении длительного времени допускается до +70о, а максимальная температура нагрева токопроводящих жил при коротком замыкании допускается до +160о.

ВВГнг-П прокладывают на открытом воздухе при условии, что исключена вероятность механической нагрузки и растягивания, на кабельных эстакадах, блоках. При монтаже следует учитывать, что минимальный изгиб ВВГнг-П составляет 7,5 наружных диаметров, а также то, что прокладку кабеля без предварительного нагрева не рекомендуется проводить в условиях низких температур (не ниже 15оС).

Конструктивные особенности кабеля

ВВГнг-П это скрутка токопроводящих медных жил (1) (с нулевой жилой или без), изолированных ПВХ-пластикатом (2) пониженной горючести.

Скрутка кабеля помещена в поливинилхлоридное покрытие (оболочку). В отличие от ВВГнг, в ВВГнг-П сердечник помещается в оболочку ПВХ (3), плоской, прямоугольной формы, где все токопроводящие жилы лежат в одной плоскости.

Материал оболочки сердечника кабеля термостойкий из огнеупорного пластиката, затрудняет горение кабеля. Негорючесть ВВГнг-П позволяет использовать его для монтажа электросети вблизи пожаро-опасных материалов (дерево, ДСП, ДВП и пр,), во взрыво-опасных помещениях.

Выгодные цены на кабель ВВГнг в «ЭлМикс»

В нашей компании вы можете купить кабель, провод и другую электротехническую продукцию по гибким ценам. Для того чтобы сделать покупку свяжитесь с нашими менеджерами по телефону или сделайте онлайн-заказ.

JCI Insight — Ингибирование метилтранферазы EZh3 улучшает работу аорты при экспериментальной аневризме грудной аорты

Аннотация

Мутации потери функции в генах, кодирующих сократительные белки, наблюдались при аневризмах грудной аорты (TAA). Чтобы понять вклад дефицита сократительного белка в патогенез TAA, мы исследовали образцы аневризмы человека. Мы обнаружили несколько продуктов сократительных генов, дефицитных в образцах TAA, и, в частности, экспрессия SM22α обратно коррелировала с размером аневризмы.SM22α-дефицитные мыши продемонстрировали вызванное беременностью расслоение аорты, а SM22α-дефицит усугубил аневризму аорты у мышей Fbn1C1039G / + (Marfan), подтверждая, что этот генный продукт является эффектором TAA. Мы обнаружили, что репрессия SM22α усиливается повышенной активностью метилтрансферазы EZh3. Эффекторы TGF-β, такие как SMAD3, были исключены из связывания SM22α-кодирующего хроматина (TAGLN) в образцах TAA, тогда как обработка ингибитором EZh3 GSK343 ​​улучшала архитектуру цитоскелета и восстанавливала экспрессию SM22α.Наконец, ингибирование EZh3 улучшало работу аорты у мышей Fbn1C1039G / + в сочетании с восстановлением экспрессии сократительного белка (включая SM22α). Вместе эти данные информируют наше понимание о дефиците сократительного белка в TAA и поддерживают поиск факторов, модифицирующих хроматин, в качестве терапевтических мишеней при заболевании аорты.

Авторы

Кристиан Л. Лино Карденас, Чейз В. Кессинджер, Кэролайн Макдональд, Арминдер С. Джассар, Эрик М. Иссельбахер, Фарук А.Джаффер, Марк Э. Линдси

×

Рисунок 1

Уменьшение членов сократительного аппарата VSMC у пациентов с ТАА.

(A) Паттерн экспрессии фенотипических маркеров VSMC в ткани аорты человека от контрольных (n = 13) и TAAD (n = 30) доноров. Потеря транскрипта TAGLN (SM22α) была более значительной у пациентов, перенесших расслоение (TAA FC = 0,55 против TAAD FC = 0,12). (B) Иммуноблоттинг-анализ белка SM22α в ткани аорты человека от контрольных (n = 7) и TAAD (n = 9) доноров.(C) Анатомическая реконструкция изображений пациентов и иммунофлуоресцентное окрашивание сократительных белков аорты человека из контрольных образцов, образцов TAA и TAAD (верхний ряд). Окрашивание образцов аорты от пациентов с помощью окрашивания Верхоффа-Ван Гизона (VVG) демонстрирует фрагментацию эластина. Масштабная линейка: 150 мкм (второй ряд). Иммунофлуоресценция образцов аорты, показывающая SM22α (пурпурный), кальпонин (Cnn) (зеленый), DAPI (синий), винкулин (красный), смоотелин (зеленый) и DAPI (синий). Масштабная шкала: 50 мкм, встроенное масштабирование 3-х кратное увеличение.(D) Типичные микрофотографии сердец и восходящих аорт мышей WT и Fbn1 C1039G / + , инъецированных латексом. Красные стрелки указывают восходящую часть аорты. Волокна эластина аорты окрашивали красителем Верхоффа-Ван Гизона (VVG) и иммунофлуоресценцией DAPI (синий), F-актина (зеленый) и Sm22α (пурпурный). Масштабная линейка: 50 мкм. (E) КПЦР-анализ транскрипта Tagln (Sm22α) в ткани и плазме аорты от 6-месячных мышей WT (n = 7) и Fbn1 C1039G / + (n = 7). (F) Корреляция тканевой экспрессии Tagln (Sm22α) с размерами аорты в аорте Fbn1 C1039G / + (n = 7) (метод наименьших квадратов, используемый для подбора кривой).(G) Иммунофлуоресцентное окрашивание сократительных белков в VMSC аорты, обработанных siCtrl или siSM22α. Шкала: 10 мкм, 3-кратное увеличение. (H) Иммуноблоттинг-анализ ингибирования SM22α и потери его партнера по связыванию Cnn в VMSC аорты. Количественное сравнение с β-актином показано ниже. (I) Обработка здоровых VSMC siSM22α индуцирует активность ММП, что оценивается с помощью желатиновой зимографии in vitro. (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, t-критерий Стьюдента, двусторонний). FC, изменение кратности; TAA, аневризма грудной аорты; TAAD, аневризма и расслоение грудной аорты; Ctrl, контроль; SMTN, смутелин; VCL, винкулин.

RUNX1 / RUNX1T1 опосредует альтернативный сплайсинг и реорганизует транскрипционный ландшафт при лейкемии

Изменение экспрессии гибридного онкогена

RUNX1 / RUNX1T1 приводит к дифференциальному сплайсингу лейкемического транскриптома

Для обнаружения потенциальной ассоциации между RUNX1 / RUNX1 и RUNX1 / RUNX1 сплайсинга, мы первоначально проанализировали опубликованные наборы данных RNA-seq, ChIP-seq и DNase-hypersensitive-site-seq (DHS-seq) на предмет связей между RUNX1 / RUNX1T1 и обработкой РНК (дополнительные данные 1).Функциональная аннотация, выполненная DAVID, выявила весьма значимое обогащение связывания RUNX1 / RUNX1T1 в локусах генов, которые подлежат альтернативному сплайсингу и вариантам сплайсинга (скорректированная частота ложных открытий — значение p или q -значение, 4,0 × 10 −23 и 1,5 × 10 −12 соответственно; Дополнительный рис. 1а, Дополнительные данные 2) 24 . Эти находки согласуются с наблюдением, что RUNX1 / RUNX1T1 может взаимодействовать с несколькими факторами сплайсинга, что указывает на прямую связь между транскрипцией, регулируемой RUNX1 / RUNX1T1, и процессингом РНК 15 .Более того, мы наблюдали, что сайты связывания RUNX1 / RUNX1T1 часто присутствуют в генах, кодирующих факторы, связанные со сплайсингом, или в их непосредственной близости (дополнительные данные 3, 4). Список таких генов включает как гены классической регуляции сплайсинга, такие как HNRNPM , RBFOX2, SF3A3 , SRSF5 , так и гены, кодирующие компоненты ядерных спеклов, включая RBM6 , SNRPD3 , SNU13 , которые являются считается зона интенсивной сварки 25,26 .Более того, анализ обогащения набора генов (GSEA) предполагает, что нокдаун RUNX1 / RUNX1T1 влияет на РНК-связывающие белки и сборку snRNP и связан с нарушением процессинга мРНК и, в частности, с путями сплайсинга (Рис. 1a; Дополнительный Рис. 1b) 27 . Эти находки убедительно подтверждают регулирующую роль этого лейкемического слитого белка в сплайсинге мРНК и предсказывают изменения в паттерне сплайсинга в ответ на возмущающую активность RUNX1 / RUNX1T1.

Рис. 1: Нокдаун RUNX1 / RUNX1T1 влияет на использование экзонов в клетках Касуми-1.

a Графики анализа обогащения набора генов для РНК-связывающих белков 55 и пути сборки snRNP Reactome. NES, нормализованная оценка обогащения; q, уровень ложного обнаружения. b Вестерн-блоттинг уровней белка RUNX1 и RUNX1 / RUNX1T1 в клетках Касуми-1 после нокдауна RUNX1 / RUNX1T1. Показан типичный результат одного из трех экспериментов. siMM, миРНК несовпадения; siRR, миРНК RUNX1 / RUNX1T1. c Распределение удерживаемых интронов (RI) между транскриптомами клеток Касуми-1, обработанных siRR и обработанных siMM.RI были обнаружены с использованием алгоритмов DESeq2 и edgeR / limma. d Точечная диаграмма, показывающая распределение siRR-специфичных и siMM-специфичных RI после многомерного сокращения данных экспрессии RI с использованием t-распределенного стохастического встраивания соседей. RI были обнаружены с использованием алгоритма edgeR / limma, и очень похожие результаты наблюдались с помощью DESeq2. e, f Графики Vulcano, показывающие дифференциальное использование экзонов, идентифицированных алгоритмами DEXSeq e или limma / diffSplice f .Оранжевые и желтые ромбы указывают на разные используемые канонические экзоны или RI, соответственно, с более чем 2-кратным изменением и q <0,1. g Диаграмма Венна, показывающая перекрытие между дифференциально используемыми экзонами (diffUE), идентифицированными с помощью алгоритмов DEXSeq, limma / diffSplice и JunctionSeq. h Диаграмма Венна, показывающая перекрытие генов с различиями, идентифицированными алгоритмами DEXSeq, limma / diffSplice и JunctionSeq. i Классификация diffUE по функциональному типу экзонов.Геномные координаты эталонных экзонов были извлечены из моделей Ensembl человеческих генов. diffUE пересекали с эталонными экзонами и подсчитывали перекрытия. Двусторонний точный тест Фишера был проведен для выявления чрезмерно представленных или недостаточно представленных типов экзонов среди diffUE против недифференциальных экзонов (non-diffUE).

Чтобы идентифицировать события дифференциального сплайсинга, регулируемые RUNX1 / RUNX1T1, мы проанализировали данные РНК-Seq t (8; 21) -положительной линии клеток AML Kasumi-1 после нокдауна RUNX1 / RUNX1T1 (Дополнительные данные 1, GSE54478).Нокдаун был достигнут электропорацией с короткой интерферирующей РНК (миРНК) siRR, нацеленной на сайт слияния мРНК RUNX1 / RUNX1T1 , в то время как миРНК с несовпадением, siMM, служила контролем 28 (рис. 1b).

События дифференциального сплайсинга были обнаружены на уровне как экзонов, так и экзон-экзонных соединений (EEJs). Дифференциально используемые экзоны (diffUE) были идентифицированы с использованием DEXSeq, limma / diffSplice и JunctionSeq, в то время как дифференциально используемые экзон-экзонные соединения (diffEEJs) были идентифицированы с использованием функциональных возможностей limma / diffSplice и JunctionSeq 29,30,31 .Этот комбинированный подход обнаружил полный набор событий дифференциального сращивания в зависимости от статуса RUNX1 / RUNX1T1.

Используя наш конвейер, мы разработали список неперекрывающихся геномных фрагментов, проанализировав 511 363 неперекрывающихся бина канонических экзонов человека, аннотированных в Ensembl 32 . Этот список экзонов был расширен за счет 3540 неперекрывающихся бункеров сохраненных интронов, обнаруженных в 2401 генах клеток Касуми-1, из которых 25% по-разному сохранялись между RUNX1 / RUNX1T1 нокдаун и контрольными клетками (дополнительные данные 5).Следует отметить, что нокдаун повлиял на удержание интронов обоими способами: 419 интронов были обнаружены исключительно в клетках, истощенных по RUNX1 / RUNX1T1, в то время как 469 интронов сохранялись только в контрольных клетках (рис. 1c, d; дополнительный рис. 1c, d). Эти специфические для состояния сохраненные интроны обнаруживают небольшую, но заметную разницу в экспрессии (Supplementary Fig. 1e-i).

Помимо дифференциально удерживаемых интронов, мы идентифицировали 395 дифференциально используемых экзонов (diffUE) в транскриптоме Kasumi-1 после нокдауна RUNX1 / RUNX1T1 (рис.1д, е; Дополнительный Рис. 1j; Дополнительные данные 6). Список идентифицированных diffUE включал 387 канонических экзонов и 8 сохраненных интронов, затрагивающих 275 генов (рис. 1ж, з). Интересно, что хотя эти diffUE были равномерно распределены по некодирующим РНК, в кодирующих белки транскриптах они были значительно обогащены экзонами 5’-UTR и истощены для экзонов CDS, 3’-UTR и мульти-типов (рис. 1i).

На уровне EEJ мы обнаружили 177 дифференциально используемых EEJ (diffEEJ) при нокдауне RUNX1 / RUNX1T1 , которые были распределены по 150 генам (рис.2а – в; Дополнительный рис. 2а; Дополнительные данные 7). Эти diffEEJs принадлежали к основным режимам альтернативного сплайсинга (Fig. 2d) и ассоциировались со всеми функциональными типами экзонов (Fig. 2e). В отличие от генов со специфическими для состояния сохраненными интронами, только 55 из 378 генов с diffUE или diffEEJ обнаруживают изменения общих уровней транскриптов после нокдауна RUNX1 / RUNX1T1 (дополнительный рис. 2b, c).

Рис. 2: Нокдаун RUNX1 / RUNX1T1 вызывает изменения экзон-экзонных связей в лейкозных клетках.

график Вулкано, показывающий дифференциальное сплайсинг экзонов, идентифицированных с помощью алгоритма limma / diffSplice. Оранжевые ромбы указывают на дифференциально используемые экзон-экзонные соединения (diffEEJs) с более чем 2-кратным изменением и q <0,1. b Диаграмма Венна, показывающая перекрытие между diffEEJ, идентифицированными алгоритмами limma / diffSplice и JunctionSeq. c Диаграмма Венна, показывающая перекрытие генов с различиями, идентифицированными с помощью алгоритмов limma / diffSplice и JunctionSeq. d Круговые диаграммы, показывающие классификацию diffEEJ и недифференциальных экзон-экзонных переходов (non-diffEEJs) в соответствии с режимами альтернативного сплайсинга. Числа указывают процент событий сварки, назначенных конкретному режиму сварки. Сложное сращивание означает, что одновременно произошло несколько (два или более) альтернативных сращивания. e Распределение сайтов сплайсинга с diffEEJ и non-diffEEJ среди различных функциональных типов экзонов. P-значения были рассчитаны с помощью теста χ 2 .Панели с и до и основаны на данных из ячеек Касуми-1.

Примечательно, что использование двух разных алгоритмов limma / diffSplice и JunctionSeq для анализа diffEEJ дало лишь минимально совпадающие результаты (рис. 2b, c). Это связано с различиями в предварительной обработке, фильтрации, нормализации и преобразовании данных, а также с использованием разных статистических моделей на этапе идентификации diffEEJ алгоритмами. Тем не менее, diffEEJ, идентифицированные как limma / diffSplice, так и JunctionSeq, могут быть подтверждены с помощью qRT-PCR (дополнительные данные 8).

RUNX1 / RUNX1T-ассоциированные альтернативно сплайсированные варианты являются отличительными чертами в образцах первичного лейкоза

Чтобы проверить, присутствуют ли diffEEJ, обнаруженные в клетках Kasumi-1, также в первичных лейкозных бластах, мы выбрали общедоступные образцы RNA-Seq от 20 пациентов с t (8; 21) -положительный AML (Дополнительные данные 1, GSE62190 и GSE67040). С помощью этого набора данных мы обнаружили около 80% связанных с Kasumi-1 diffEEJ, которые широко представлены в транскриптоме первичных t (8; 21) -положительных лейкозных бластов (рис.3а). Это обширное совпадение согласуется с ранее наблюдаемой высокой корреляцией между t (8; 21) -положительными клеточными линиями и материалом пациентов в отношении экспрессии генов и доступности хроматина, и доказывает, что Kasumi-1 является релевантной модельной системой для гена, регулируемого RUNX1 / RUNX1T1. выражение 19,21,23,33 .

Рис. 3: Альтернативно сплайсированные варианты, ассоциированные с RUNX1 / RUNX1T1, являются отличительными чертами в образцах первичной лейкемии.

a График для скрипки, показывающий уровень обогащения соединений экзон-экзон Касуми-1 в транскриптоме первичных t (8; 21) -положительных лейкозных бластов из 20 образцов пациентов. P Значения были рассчитаны с помощью двустороннего U-критерия Манна – Уитни. b, c Независимый компонентный анализ t (8; 21) -положительных клеток AML с нормальными CD34-положительными клетками b или других подтипов AML c . Этот анализ включал 20 образцов каждого типа клеток. Для каждого образца была определена экспрессия 84 743 экзон-экзонных переходов.

Затем мы проверили, были ли эти события сплайсинга специфическими особенностями t (8; 21) -положительного AML, сравнив события сплайсинга, обнаруженные в t (8; 21) клетках AML, с таковыми в нормальных клетках или клетках из других подтипов AML (дополнительные Данные 1).С этой целью мы проанализировали данные РНК-Seq нормальных CD34-положительных клеток, полученных из костного мозга человека (GSE102881, GSE111085, GSE63569 и GSE69239), пуповинной крови (GSE48846, GSE69905 и GSE71689) и периферической крови (GSE102881, GSE107218, GSE68925, GSE87285, GSE и GSE92274) в дополнение к клеткам AML с нормальным кариотипом (GSE49642 и GSE52656), inv (16) (GSE108266, GSE62190 и GSE67039) или перегруппированным локусом MLL (GSE6219039), GSE621906, GSE С помощью этого всеобъемлющего набора данных анализ независимых компонентов выявил три независимых подгруппы EEJ, которые четко отделяют t (8; 21) -положительные клетки AML от нормальных CD34-положительных клеток (рис.3b; Дополнительные данные 9). Мы обнаружили, что 53% diffEEJ, идентифицированных в Kasumi-1, присутствовали в этих независимых компонентах с высокой статистической значимостью (отношение шансов 5,42, p <2,2 × 10 −16 ). Аналогичный результат был получен при сравнении t (8; 21) -положительных клеток с другими типами лейкемии (рис. 3c; дополнительные данные 10) с 48% тех diffEEJ, идентифицированных в Kasumi-1, способствующих различению t (8; 21) -положительный ОМЛ от других подтипов ОМЛ (отношение шансов 2.67, p = 4,1 × 10 −12 ).

Вместе эти результаты ясно показывают, что RUNX1 / RUNX1T1-зависимые события сплайсинга характеризуют особенности транскриптома t (8; 21) -положительных клеток AML. Возникновение этих событий в сочетании с выбранными RUNX1 / RUNX1T1-независимыми событиями сплайсинга отличает t (8; 21) -положительные от t (8; 21) -отрицательные AML-клетки и нормальные гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники.

Модуляция локальных эпигенетических меток с помощью RUNX1 / RUNX1T1 влияет на альтернативный сплайсинг

Затем мы определили механизмы, с помощью которых RUNX1 / RUNX1T1 контролирует события сплайсинга при t (8; 21) -приводимой лейкемии.Связывание RUNX1 / RUNX1T1 в определенных геномных сайтах влияет на локальный статус хроматина, включая изменения в модификациях гистонов и доступность хроматина 14,19,20 (Fig. 4a, h4K9Ac data). Эти эпигенетические изменения были связаны с перераспределением пиков РНК pol II, указывая на изменения в скоростях транскрипции после нокдауна RUNX1 / RUNX1T1 (рис. 4a, данные RNA pol II).

Рис. 4: RUNX1 / RUNX1T1 -зависимые события дифференциального сплайсинга в клетках Kasumi-1 связаны с открытым хроматином.

a Столбчатый график, показывающий распределение сайтов, занятых RUNX1 / RUNX1T1, h4K9Ac и РНК pol II, с нокдауном RUNX1 / RUNX1T1 или без него. Верхняя панель показывает распределение для всех сайтов, нижняя панель показывает только распределение сайтов связывания, перекрывающихся с 5 ’сайтами сплайсинга diffEEJ. b Ассоциация сайтов сплайсинга diffEEJs с открытым хроматином. P Значения были рассчитаны с помощью точного двустороннего теста Фишера. c График скрипки, изображающий позиционные отношения между каноническими (c; n = 117) и альтернативными (a; n = 57) 5 ’сайтами сплайсинга diffEEJ и метками открытого хроматина. P Значения были рассчитаны с помощью двустороннего U-критерия Манна – Уитни. Желтые горизонтальные толстые линии представляют собой медианное значение распределения расстояний, черные вертикальные прямоугольные рамки показывают межквартильный диапазон, а черные вертикальные линии представляют собой 95% доверительный интервал. d Влияние близости к сайтам связывания RUNX1 / RUNX1T1, пикам Pol II РНК, модификациям гистона h4K9Ac и сайтам гиперчувствительности к ДНКазе I на вероятность diffEEJ и non-diffEEJs в транскриптоме лейкозных клеток.

Так как кинетика транскрипции может влиять на альтернативный сплайсинг 34,35 , мы исследовали потенциальное влияние RUNX1 / RUNX1T1-зависимой организации хроматина и транскрипции на события сплайсинга более подробно. Сайты сплайсинга diffEEJs были значительно обогащены в областях открытого хроматина (отмеченных сайтами гиперчувствительности к ДНКазе I и сайтами модификации гистона h4K9Ac) и замедлили элонгацию РНК pol II по сравнению с сайтами сплайсинга non-diffEEJs (рис. 4b). Сравнение канонических сайтов сплайсинга с diffEEJ продемонстрировало более близкую близость альтернативных 5 ’сайтов сплайсинга (но не 3’ сайтов сплайсинга) к открытым участкам хроматина и сайтам, связанным с h4K9Ac и РНК pol II (рис.4в). Точно так же альтернативные 5’-сайты сплайсинга также показали тенденцию к более близкому расположению к сайтам RUNX1 / RUNX1T1. Эти данные предполагают, что сайты сплайсинга diffEEJs, которые заняты h4K9Ac и РНК pol II, контролируются RUNX1 / RUNX1T1.

Все вышеперечисленные находки указывают на тесную связь между состоянием хроматина и дифференциальным сплайсингом после нокдауна RUNX1 / RUNX1T1 . Поскольку эпигенетический ландшафт влияет на альтернативный сплайсинг только в сотрудничестве с характеристиками последовательностей пре-мРНК 36 , мы интегрировали эпигенетические данные с многомерными данными последовательностей и рассчитали частичную зависимость для каждой эпигенетической метки, используя подход случайного леса (дополнительные подробности см. ).Этот анализ демонстрирует, что дифференциальному сплайсингу способствует близость к сайтам RUNX1 / RUNX1T1, RNA pol II и h4K9Ac, а также к сайтам гиперчувствительности к ДНКазе I (рис. 4d), и подчеркивает влияние состояния хроматина на дифференциальный сплайсинг после RUNX1 / RUNX1T1. сбить.

Отсроченный сплайсинг чувствителен к регуляции с помощью RUNX1 / RUNX1T1

Большинство событий сплайсинга являются котранскрипционными. Однако в некоторых случаях регулируемого альтернативного сплайсинга удаление интрона может быть отложено до высвобождения пре-мРНК из сайта транскрипции 37,38 .Имея это в виду, мы проанализировали растущую РНК в клетках Касуми-1 на предмет EEJ, которые были общими для растущей и полной, то есть зрелой РНК (рис. 5a). Эти EEJ были сгруппированы в два класса. Первый класс (non-diffEEJs) включал возникающие EEJ, которые не становились дифференциальными EEJ на уровне общей РНК. Напротив, второй класс (diffEEJs) собирал события, которые были идентифицированы как diffEEJs на уровне общей РНК.

Рис. 5: Формирование diffEEJ в клетках Kasumi-1 задерживается по сравнению с non-diffEEJs.

a Базовая статистика выравнивания для наборов данных формирующейся РНК и общей РНК, полученных из клеток лейкемии, обработанных siMM. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. Очень похожие результаты наблюдались с клетками, обработанными siRR. b siRNA-опосредованный нокдаун RUNX1 / RUNX1T1 , как измерено по экспрессии возникающей РНК. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. c Многоплотные графики количества EEJ, идентифицированных в формирующейся РНК (левая панель) или тотальной РНК (правая панель).Эти графики основаны на данных RNA-Seq, полученных для лейкозных клеток, обработанных siMM или siRR. Все EEJ, идентифицированные на уровне зарождающейся РНК и общей РНК, были сгруппированы (см. Основной текст для дальнейшего объяснения процедуры классификации) в non-diffEEJ или diffEEJ, и количество этих событий было нанесено на график. Каждая линия представляет данные, усредненные по трем независимым биологическим репликам. d Экспрессия генов без (гены non-diffEEJs, n = 10851) или с дифференциальным сплайсингом (повышенная или пониженная регуляция генов diffEEJs, n = 85) на уровне зарождающейся РНК. и Экспрессия генов без (гены non-diffEEJs, n = 9836) или с дифференциальным сплайсингом (повышенная или пониженная регуляция генов diffEEJs, n = 150) на уровне общей РНК. f Сравнение длин интронов у non-diffEEJ ( n = 104925) и diffEEJ ( n = 177). В d , e и f коробчатые диаграммы суммируют данные экспрессии, усредненные по трем независимым биологическим репликам. На каждой прямоугольной диаграмме горизонтальная линия представляет собой медианное значение распределения экспрессии, прямоугольник показывает межквартильный диапазон, а усы — это минимум и максимум. P Значения были рассчитаны с помощью двустороннего U-критерия Манна – Уитни.

Интересно, что экспрессия diffEEJs (на которую влияет нокдаун RUNX1 / RUNX1T1 ; рис. 5b) обнаруживает гораздо более сильное бимодальное распределение, приводящее к более низкой медиане по сравнению с non-diffEEJs (рис. 5c, дополнительная таблица 1). Для формирующейся РНК количество diffEEJ с низким содержанием значительно превышало количество многообещающих, в то время как для тотальной РНК верно обратное. Напротив, картина распределения non-diffEEJs лишь немного сдвинулась в сторону более высоких количеств.Важно отметить, что ни уровни экспрессии дифференциально сплайсированных генов по сравнению с недифференциально сплайсинговыми генами, ни распределение длин интронов существенно не различались между non-diffEEJs и diffEEJs и, таким образом, не являются причиной наблюдаемых сдвигов (Fig. 5e, f). Таким образом, эти находки предполагают наличие дифференциальных событий сплайсинга, которые подвергаются отложенной обработке. Более того, они подразумевают, что отсроченный сплайсинг более чувствителен к геномным и транскриптомным пертурбациям, вызванным изменениями в экспрессии RUNX1 / RUNX1T1 .

Дифференциальный сплайсинг производит белки с уникальной структурой консервативных доменов и влияет на множественные клеточные процессы.

Затем мы оценили in silico потенциальные функциональные последствия дифференциального сплайсинга, связанного с RUNX1 / RUNX1T1. Обогащенный анализ с наборами генов Gene Ontology показал, что дифференциальное сплайсинг особенно влияет на гены, контролирующие синтез, транспорт, нацеливание и локализацию белков, адгезию клеток и активацию гранулоцитов (рис. 6a).

Рис. 6: Дифференциальный сплайсинг, управляемый слитым белком, расширяет белковое пространство.

a Карта обогащения наборов генов, обогащенных онтологией генов, по всем генам с дифференциальной экспрессией и / или дифференциальным сплайсингом. Узлы представляют собой значительно обогащенные наборы генов, а размер узла пропорционален количеству членов в наборе генов. Края указывают на перекрытие генов между узлами, а толщина краев эквивалентна степени перекрытия генов между узлами.Функционально связанные наборы генов сгруппированы и названы. b Коробчатая диаграмма, изображающая кодирующий потенциал 500 случайно выбранных транскриптов, каждый из генов домашнего хозяйства и генов lincRNA, и всех 752 транскриптов генов, затронутых дифференциальным сплайсингом в клетках Касуми-1. На каждом прямоугольном графике горизонтальная линия представляет собой медианное значение распределения вероятностей, прямоугольник показывает межквартильный диапазон, а усы — минимум и максимум. c Столбчатые диаграммы, изображающие классификацию кодирующих последовательностей в транскриптах (верхняя панель) и белков, транслируемых in silico (нижняя панель), на которые влияет дифференциальный сплайсинг.На верхней панели все транскрипты были классифицированы по некодирующим (не было обнаружено значимых открытых рамок считывания), кодированию белка с помощью кодонов преждевременной терминации и кодированию белка со зрелыми кодонами терминации. На нижней панели все транскрипты, кодирующие белок, были транслированы in silico, и предсказанные белки были сопоставлены blastp с неизбыточным набором белков человека. Идентификационные данные белков указаны внизу. d Столбчатые графики, показывающие влияние RUNX1 / RUNX1T1 на частоту вариантов белка. и Диаграмма Венна, визуализирующая распределение 118 доменных суперсемейств среди белков, предсказанных in silico. f Карта обогащения доменно-центрированного суперсемейства, обогащенного онтологией генов, устанавливается по всем генам с дифференциальным сплайсингом. Узлы представляют собой значительно обогащенные наборы суперсемейства, а размер узла пропорционален количеству членов в наборе суперсемейства. Ребра указывают на перекрытие суперсемейства между узлами, а толщина ребер эквивалентна степени перекрытия суперсемейства между узлами.Функционально связанные наборы суперсемейства сгруппированы и названы. Цвета круговой диаграммы: (а) повышенная, (б) пониженная, (в) без изменений.

Для дальнейшей детализации вышеуказанных функциональных результатов мы использовали данные RNA-Seq (Supplementary Data 1, GSE54478) и алгоритм Cufflinks / Cuffdiff для сборки полноразмерных молекул РНК, а также для количественной оценки их экспрессии в клетках Касуми-1. Мы обнаружили, что гены, на которые влияет RUNX1 / RUNX1T1-зависимый дифференциальный сплайсинг, кодируют 752 транскрипта, из которых 214 изоформ были дифференциально сплайсированы.Здесь и ниже термин «изоформа с дифференциальным сплайсингом» обозначает молекулу РНК по меньшей мере с одним дифференциальным соединением экзон-экзон (с повышенным или пониженным регулированием), в то время как недифференциальная изоформа представляет собой транскрипт без каких-либо diffEEJ.

Из всех вышеупомянутых транскриптов 75% потенциально кодировали белок, в то время как остальные были некодирующими РНК (рис. 6b, c, верхняя панель). Мы сопоставили in silico транслируемые белки с человеческими белками NCBI RefSeq (выпуск 92, последнее изменение — 18 марта 2019 г.) и новейшие неизбыточные выпуски трансляций CDS GenBank, UniProtKB / SwissProt, банка данных по белкам, информационного ресурса о белках и последовательности пептидов / белков. База данных белков (обновлена ​​11 апреля 2019 г.) с использованием NCBI blastp 39 .Из 1055 белков, транслируемых in silico, 722 белка были на 90% или более идентичны белкам, аннотированным в общедоступных базах данных (рис. 6c, нижняя панель). Такие белки образуют четкий пик на кривой распределения идентичности, и для уменьшения шума только эти белки были выбраны для последующего анализа.

Значительная часть транслируемых in silico белков была подобна нативным человеческим белкам (рис. 6d). В то же время существовали также разные удлиненные и укороченные изоформы белков.Такие изоформы могут потенциально включать новые домены или могут не иметь доменов, важных для правильного связывания, локализации и функции белка, при этом другие функциональные области остаются неизменными.

Для дальнейшей структурной детали мы назначили SCOP-домены для высоко идентичных in silico транслируемых белков с использованием скрытых марковских моделей SUPERFAMILY, и мы идентифицировали 225 консервативных доменов в этих белках (Structural Classification of Proteins database, release 1.75, June 2009) 40, 41 .Выявленные домены принадлежат 146 семействам доменов. Около 45% этих семейств доменов являются общими для белков, транслируемых из дифференциально (повышенная или пониженная регуляция) и недифференциально (без изменений) сплайсированных изоформ РНК. Однако 16% доменных семейств связаны с изоформами РНК, подвергнутым дифференциальному сплайсингу. Эта уникальность дифференциальных белков надежна и сохраняется даже тогда, когда домены объединяются в суперсемейства доменов (Fig. 6e).

Наконец, мы использовали доменно-ориентированный метод генной онтологии для функциональной аннотации доменных архитектур белков, предсказанных in silico 42 .Мы применили тест обогащения отдельно для белков, транслируемых из дифференциально сплайсированных (повышенная или понижающая регуляция) или недифференциально сплайсированных изоформ РНК, и мы интегрировали результаты с помощью EnrichmentMap 43 . Этот подход in silico показал, что домены, кодируемые дифференциальными изоформами РНК, в основном участвуют в глобальной регуляции клеточных процессов, молекулярном связывании (включая связывание с белками), транспорте и локализации молекулярных веществ и клеточных коммуникациях (рис.6е).

RUNX1 / RUNX1T1 влияет на дифференциальный сплайсинг, контролируя использование альтернативных промоторов.

Сайты связывания RUNX1 / RUNX1T1 обогащены промоторными и интронными областями, что указывает на то, что слитый белок напрямую влияет на транскрипцию нескольких генов 14,19,21 . Соответственно, в нашем наборе данных diffUE и diffEEJs мы обнаружили, что 38% генов с дифференциальным сплайсингом также были обогащены сайтами связывания слитых белков (дополнительные данные 6, 7). Это обогащение было значительно выше, чем для генов с недифференциальным сплайсингом (отношение шансов 2.47 и p = 2,5 × 10 −15 согласно двустороннему точному критерию Фишера). Основываясь на этих данных, мы предположили, что события дифференциального сплайсинга могут возникать в результате выбора альтернативных TSS под контролем слитого белка. Действительно, мы идентифицировали 775 TSS, связанных с дифференциальной транскрипцией (более чем 2-кратное изменение, q <0,1) в геноме клеток Kasumi-1 после нокдауна RUNX1 / RUNX1T1 (рис. 7a). Среди них выход из строя RUNX1 / RUNX1T1 привел к дифференциальному использованию 112 альтернативных TSS (изменение более чем в 2 раза, q <0.1) (рис. 7б). Потеря RUNX1 / RUNX1T1 увеличивает доступность хроматина и занятость RUNX1 в альтернативных TSSs в такой же степени, как и в общей группе TSSs, управляющих дифференциальной транскрипцией (Fig. 7a, Supplementary Fig. 3a). Таким образом, нарушение RUNX1 / RUNX1T1 реорганизует структуру хроматина альтернативных TSS, что приводит к их транскрипционной активации.

Рис. 7: RUNX1 / RUNX1T1 влияет на дифференциальный сплайсинг, контролируя альтернативные стартовые сайты транскрипции (TSS).

График Vulcano дифференциальной экспрессии различных TSS в геноме клеток Касуми-1 после нокдауна RUNX1 / RUNX1T1 .Дифференциально выраженные TSS (как минимум 2-кратное изменение экспрессии, p <0,005, q <0,1) показаны красными квадратами. b Дифференциальное использование альтернативных TSS в геноме клеток Касуми-1 после нокдауна RUNX1 / RUNX1T1 . Дифференциально используемые TSS (как минимум 2-кратное изменение экспрессии, p <0,0007, q <0,1) показаны красными квадратами. c Обогащение сайта гиперчувствительности к ДНКазе I-Seq считывает в геномных областях, окружающих недифференциальные TSS, дифференциально экспрессируемые TSS или дифференциально используемые TSS.В этом анализе использовали только геномные области TSS, которые перекрывают пики связывания RUNX1 / RUNX1T1. На каждой прямоугольной диаграмме горизонтальная линия представляет собой медианное значение распределения экспрессии, прямоугольник показывает межквартильный диапазон, а усы — это минимум и максимум. P Значения были рассчитаны с помощью двустороннего U-критерия Манна – Уитни. d IGV-снимок экрана, показывающий связывание RUNX1 / RUNX1T1 и считывание РНК из возникающих и общих РНК-Seq в 5’-концевой области локуса PARL для клеток Касуми-1, обработанных siMM и обработанных siRR.Экзоны и соединения экзон-экзон обозначены буквами E и J соответственно и пронумерованы. Дифференциально используемая развязка J3 выделена фиолетовым цветом. Нижняя схема, изображающая собранные запонками репрезентативные полноразмерные транскрипты гена PARL , экспрессируемого в клетках Касуми-1. Для каждого транскрипта значения log 2 (FC) siRR / siMM и q на основе Cuffdiff, а также размер белков, предсказанных in silico, указаны в скобках. Кроме того, также показаны положения сайтов начала транскрипции, определенных Cuffdiff.Внизу панели схема, показывающая целевое расположение dCas9-KRAB, которое было нацелено на второй консенсусный сайт RUNX1. e Схематическое изображение положений связывания праймеров для основанной на кПЦР проверки дифференциального сплайсинга в гене PARL . Структура ожидаемых ампликонов показана внизу рисунка. f Проверка на основе кПЦР дифференциального сплайсинга транскриптов PARL в двух условиях обработки миРНК в транскриптоме двух t (8; 21) -положительных клеточных линий.Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. г Индукция транскрипции PARL-03 после нокдауна RUNX1 / RUNX1T1 с индукцией dCas9-KRAB или без нее. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. P Значение было рассчитано с помощью двустороннего критерия t Стьюдента.

Когорта генов, в которых RUNX1 / RUNX1T1 репрессирует альтернативные TSS, включает ген киназы NAD NADK , RUNX1T1 paralogue CBFA2T3 , ген киназы RPS6KA1 и rhomboid киназы 7).В каждом случае потеря RUNX1 / RUNX1T1 активировала альтернативный TSS, который либо воздействовал исключительно на 5′-UTR, как в случае NADK , предсказывалось изменение только N-концевых аминокислот соответствующего белка (например, CBFA2T3, RPS6KA1 ) или могли вызвать более крупные N-концевые делеции (например, PARL ).

Например, RUNX1 / RUNX1T1 занимает ген PARL , который кодирует киназу, контролирующую митофагию и апоптоз и связанный с клиническим исходом ОМЛ (дополнительный рис.3б) 44,45 . Сайт связывания RUNX1 / RUNX1T1 располагается в первом интроне на 6,6 т.п.н. ниже канонического PARL TSS1. Нокдаун RUNX1 / RUNX1T1 устраняет его связывание с этим геномным элементом и активирует 3’-проксимально расположенные TSS2 и TSS3 (рис. 7d, e). В частности, транскрипция неканонического экзона из TSS3 и соответствующего соединения экзон-экзон J3 дала альтернативный транскрипт PARL-03 (фиг. 7d). Наблюдаемое увеличение общих уровней транскрипта PARL и белка в t (8; 21) -бластах после нокдауна RUNX1 / RUNX1T1 в основном связано с альтернативным транскриптом PARL-03 (дополнительный рис.3в, г). Кроме того, соединение J3 было специфической особенностью транскриптомов первичных подтипов AML с более зрелым иммунофенотипом, чем t (8; 21) AML, но не t (8; 21) -позитивными AML, ни нормальным CD34-положительным гематопоэтическим стволом и предшественником. клетки (дополнительный рис. 3e). Эти данные подтверждают мнение о том, что неканонический TSS3 активируется в некоторых AML, но подавляется в подтипе t (8; 21) AML.

Далее мы исследовали функциональность этого элемента, нацелив эндонуклеазо-дефицитный репрессор dCas9-KRAB на сайт на 200 п.н. выше TSS3 (рис.7г). Экспрессию dCas9-KRAB индуцировали добавлением доксициклина к среде. По сравнению с клетками Касуми-1, обработанными несовпадающими миРНК, нокдаун RUNX1 / RUNX1T1 вызывал 20-кратное увеличение экспрессии PARL-03 без значительного влияния на канонические уровни PARL-01 (фиг. 7g). Индукция dCas9-KRAB не влияла на экспрессию PARL-01 с изменениями в 0,98 и 1,01 раза для клеток, обработанных siMM и siRR, соответственно. Однако индукция dCas9-KRAB значительно снижала индукцию транскрипции PARL-03 , которая была вызвана потерей RUNX1 / RUNX1T1 (рис.7г). Эти данные подтверждают, что транскрипция PARL-03 регулируется промотором, расположенным в 6,6 т.п.н. в каноническом интроне 1, и дополнительно подтверждают представление о том, что связывание RUNX1 / RUNX1T1 с этим элементом репрессирует его потенциал активации транскрипции.

В качестве альтернативы потеря связывания RUNX1 / RUNX1 / T1 может также привести к репрессии вместо активации альтернативных TSS, как в случае LIMS1 , где репрессия TSS2 привела к существенному снижению уровня изоформы белка LIMS1 e ( Дополнительный рис.4). Таким образом, подобно канонической регуляции транскрипции, RUNX1 / RUNX1T1 может как репрессировать, так и активировать альтернативные TSS.

Активация альтернативного TSS в гене

RPS6KA1 компенсирует потерю RUNX1 / RUNX1T1

Другой пример контроля альтернативного TSS под действием RUNX1 / RUNX1T1 обеспечивается локусом RPS6KA1 . RUNX1 / RUNX1T1 связывается с сайтом в интроне 1, расположенным на 12 т.п.н. ниже TSS1 (фиг. 8a). Потеря связывания RUNX1 / RUNX1T1 приводит к трехкратному увеличению уровней транскрипта и белка в t (8; 21) клетках AML (рис.8а, панель «Запонки»; Рис. 8б, в). Это увеличение в основном связано с двадцатикратной активацией TSS2, расположенного в непосредственной близости от сайта связывания RUNX1 / RUNX1T1.

Рис. 8: Нокдаун RUNX1 / RUNX1T1 приводит к дифференциальному сплайсингу транскриптов RPS6KA1 в клетках Касуми-1.

снимок экрана IGV, показывающий связывание RUNX1 / RUNX1T1 и считывание РНК из возникающих и общих РНК-Seq в 5’-концевой области локуса RPS6KA1 для siMM-обработанных и siRR-обработанных клеток Касуми-1.E, экзоны; J, экзон-экзонный переход. Нижняя схема, изображающая транскриптов RPS6KA1 . diffEEJ заключены в рамку и выделены желтым цветом. b. Количественное определение на основе КПЦР изменения активности различных сайтов начала транскрипции гена RPS6KA1 после нокдауна RUNX1 / RUNX1T1 . Также указан общий уровень экспрессии («общий») гена RPS6KA1 . * p = 0,029, ** p = 0,025, # p = 0.022 и ## p = 0,014 с односторонним t-критерием Стьюдента для одной выборки. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. c Нокдаун RUNX1 / RUNX1T1 приводит к статистически значимым ( p = 0,00504 (*)) изменениям уровня белка RPS6KA1 в лейкозных клетках. Значение P рассчитывали с использованием одностороннего t-критерия Стьюдента для одной выборки с μ 0 = 1. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. d Дифференциальная экспрессия гена RPS6KA1 в t (8; 21) положительных и отрицательных AML.Уровни экспрессии генов были взяты из наборов данных TGCA-LAML ( n = 173) и GEO / ENA-AML ( n = 80). Для набора данных TGCA-LAML использовали значения RSEM нормализованной экспрессии генов. Нормализованная экспрессия генов из набора данных GEO / ENA-AML рассчитывалась как RPKM. На каждом графике скрипки горизонтальная желтая линия представляет собой медианное распределение экспрессии, прямоугольник показывает межквартильный диапазон, а усы — минимум и максимум. P Значения были рассчитаны с помощью двустороннего U-критерия Манна – Уитни. e Выживаемость пациентов с ОМЛ в зависимости от экспрессии гена RPS6KA1 . Этот график выживаемости основан на наборе данных TCGA-LAML ( n = 173). Зависимость выживаемости пациентов от экспрессии генов рассчитывалась в соответствии с регрессионной моделью пропорциональных рисков Кокса. f Влияние ингибирования RPS6KA1 на клоногенность t (8; 21) клеток AML. Клетки Kasumi-1 подвергали электропорации с указанными миРНК с последующим высевом в полутвердую среду, содержащую указанные концентрации ингибитора RPS6KA1.Данные были нормализованы относительно клоногенности siMM электропорированных и необработанных клеток лейкемии BI-D1870. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение четырех независимых экспериментов. * p = 0,053, ** p = 0,012, # p = 0,008 и ## p = 0,001 с односторонним t-критерием Стьюдента относительно соответствующего исходного уровня в необработанных клетках.

RPS6KA1 кодирует рибосомную киназу 1 (RSK1, pp90 RSK1 ), которая способствует пролиферации и выживанию клеток, связывая передачу сигналов MAPK с путем MTOR и ингибируя проапоптотические и антипролиферативные факторы, включая BAD и CDKN1B (также известные как p27) 46 .Интересно, что RUNX1 / RUNX1T-положительный AML экспрессирует значительно меньшие количества RPS6KA1 транскриптов, чем другие подтипы AML (фиг. 8d). Кроме того, высокие уровни экспрессии этого гена коррелируют с худшим клиническим исходом (рис. 8e). Поэтому мы задались вопросом, может ли повышающая регуляция RPS6KA1 спасти t (8; 21) клеток AML от временной потери RUNX1 / RUNX1T1 и связанной с этим с нарушенной способностью к самообновлению.

С этой целью мы воспользовались преимуществом RSK-специфического ингибитора BI-D1870 и исследовали влияние ингибирования RPS6KA1 на клоногенный потенциал t (8; 21) клеток AML в качестве суррогатного считывания лейкемического самообновления.В общем, ингибирование RPS6KA1 существенно ухудшает клоногенный рост дозозависимым образом (фиг. 8f). Однако нокдаун RUNX1 / RUNX1T1 сенсибилизирует лейкемические клетки к ингибированию RPS6KA1: один BI-D1870 снижает клоногенность с очевидным IC 50 600 нМ, предшествующий нокдаун RUNX1 / RUNX1T1 снижает это значение до 100 нМ. В заключение, альтернативное использование TSS и связанная с этим повышенная экспрессия RPS6KA1 компенсировала потерю RUNX1 / RUNX1T1, что убедительно свидетельствует о том, что RPS6KA1 является фармакологической мишенью для t (8; 21) AML.Поскольку идентификация мишени обычно фокусируется на генах и белках с повышенными уровнями экспрессии 23 , эти данные также подтверждают ценность рассмотрения генных продуктов, репрессированных онкогеном, в качестве кандидатов для терапевтического вмешательства.

RUNX1 / RUNX1T1 контролирует альтернативный сплайсинг посредством дифференциальной экспрессии факторов сплайсинга

Около 60% событий дифференциального сплайсинга в клетках Касуми-1 не могут быть объяснены проксимальным связыванием RUNX1 / RUNX1T1, что указывает на то, что они не находятся под прямым контролем слитого белка .Однако мы и другие ранее показали, что t (8; 21) -положительные лейкозные клетки имеют специфическую сигнатуру генов, кодирующих факторы сплайсинга и экспрессию генов наблюдения за мРНК, которые могут влиять на паттерны сплайсинга и количество изоформ РНК 35,47,48, 49,50,51,52 . Эта сигнатура настолько уникальна, что позволяет отличить лейкозные от нормальных кроветворных клеток (дополнительный рис. 5a, b). Более того, корреляционный анализ подтвердил высококоординированную экспрессию генов, кодирующих факторы сплайсинга, и гены наблюдения за мРНК с RUNX1 / RUNX1T1 в t (8; 21) -содержащих клетках AML (дополнительный рис.5в). Более того, сайты связывания RUNX1 / RUNX1T1 часто присутствовали в генах, кодирующих факторы, связанные со сплайсингом, или в их непосредственной близости (дополнительные данные 3, 11). Следовательно, мы предположили, что RUNX1 / RUNX1T1-зависимые изменения в экспрессии генов процессинга РНК могут быть ответственны за события дифференциального сплайсинга в клетках Kasumi-1.

Путем объединения данных RNA-Seq (Supplementary Data 1, GSE54478) и микрочипа (Supplementary Data 1, GSE29223) и трех алгоритмов (Cufflinks / Cuffdiff, DESeq2 и edgeR / limma), мы идентифицировали 42 гена, кодирующих факторы сплайсинга, и 14 мРНК. гены наблюдения со статистически значимой дифференциальной экспрессией в клетках Касуми-1 после нокдауна RUNX1 / RUNX1T1 (дополнительные данные 11; рис.9а, б). Из них 16 генов, включая USB1 , связаны с сайтами связывания RUNX1 / RUNX1T1, что означает, что они являются прямыми генами-мишенями (рис. 9c, дополнительные данные 11).

Рис. 9: RUNX1 / RUNX1T1 косвенно влияет на дифференциальный сплайсинг в клетках Kasumi-1.

a Гистограмма, показывающая влияние нокдауна RUNX1 / RUNX1T1 на экспрессию генов наблюдения за мРНК (SurG), генов, кодирующих факторы сплайсинга (SplG) и гены факторов транскрипции (TFG), связанных со сплайсингом.Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов кПЦР. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 с односторонним t-критерием Стьюдента. b График, показывающий корреляцию между проверкой RNA-seq и q-PCR дифференциальной экспрессии генов, обрабатывающих РНК. c IGV снимок экрана, изображающий связывание RUNX1 / RUNX1T1 и чтение RNA-Seq для локуса USB1 . d Схема Cytoscape, показывающая RUNX1 / RUNX1T1-центрированную генную регуляторную сеть генов, кодирующих регуляторы сплайсинга и факторы надзора за мРНК.Термины «гены с усиленной регуляцией» и «гены с пониженной регуляцией» относятся к изменению экспрессии генов после нокдауна RUNX1 / RUNX1T1 . Положительно и отрицательно коэкспрессируемые гены связаны зелеными и красными краями соответственно. Примеры генов из каждой группы показаны в соответствующих пунктирных прямоугольниках. e Влияние силы мотивов факторов сплайсинга на вероятность появления non-diffEEJ и diffEEJ в лейкозных клетках. Эти графики частичной зависимости основаны на результатах 1000 независимых запусков мета-классификатора случайных лесов и 1000 деревьев классификации для каждого случайного леса за запуск.

Однако гены, кодирующие факторы сплайсинга, и гены наблюдения за мРНК также могут косвенно регулироваться посредством опосредованного слитым белком контроля экспрессии факторов транскрипции. Чтобы проверить эту гипотезу, мы реконструировали регуляторную сеть генов для тех генов, которые кодируют факторы сплайсинга и гены наблюдения за мРНК, экспрессия которых значительно изменилась при истощении RUNX1 / RUNX1T1 (рис. 9d). Эта сеть была выведена из микрочипов, RNA-Seq и данных биоинформатики (см. Дополнительные методы для получения дополнительной информации).Реконструированная сеть предполагает сложное взаимодействие экспрессии между гибридным белком, факторами транскрипции и факторами, участвующими в сплайсинге и надзоре за мРНК. Следовательно, факторы можно классифицировать в соответствии с их реакцией на статус RUNX1 / RUNX1T1. Одна группа включает RBFOX2 и несколько hnRNP (HNRNPDL, HNRNPLL и HNRNPR) с измененными уровнями экспрессии при нокдауне RUNX1 / RUNX1T1, в то время как другие hnRNP, такие как HNRNPA3, HNRNPF и HNRNPh2, не были затронуты 11) (.

На основе вышеупомянутой модели прогнозирования (см. Раздел «Модуляция локальных эпигенетических меток с помощью RUNX1 / RUNX1T1 влияет на альтернативный сплайсинг»), мы разработали короткий список характеристик последовательности, которые представляют собой наиболее важные предикторы того, существует ли соединение экзон-экзон. дифференциальный или нет. Этот короткий список включал частоту и силу мотивов для факторов сплайсинга HNRNPA3, MBNL1, PTBP1, RBFOX2, SRSF7 и YBX1 (дополнительные данные 12). Профилирование частичной зависимости указывает на сильную нелинейную связь между вероятностью класса EEJ и частотой или силой мотивов регулятора сплайсинга.Мотивы для всех факторов сплайсинга из этого списка аналогичным образом повлияли на различие между дифференциальными и недифференциальными событиями сплайсинга. Например, существует положительная связь между силой мотива фактора сплайсинга YBX1 на 3′-конце интрона и вероятностью diffEEJ, а также в основном отрицательная связь между количеством мотивов SRSF7 в нижележащем экзоне и дифференциальным сплайсингом (рис. . 9e).

Для дальнейшей проверки вышеупомянутых результатов мы также провели анализ мотивов, основанный на нескольких независимых наборах данных связывания факторов сплайсинга 53,54,55 .Этот анализ подтвердил ассоциацию между мотивами некоторых факторов сплайсинга и дифференциальным сплайсингом в транскриптоме клеток Kasumi-1 после нокдауна RUNX1 / RUNX1T1 (Supplementary Data 13). Более того, наши экспериментальные данные также указывают на существование такой связи. Напр., Две t (8; 21) линии клеток AML Kasumi-1 и SKNO-1 экспрессируют неканонический вариант сплайсинга TRAPPC2L, лишенный экзона 4 (Supplementary Fig. 6) 56,57 . TRAPPC2L не является прямой мишенью слитого белка, но данные eCLIP из клеток K562 предполагают, что SRSF7 связывается со всеми экзонами TRAPPC2L (дополнительный рис.6г). Интересно, что в то время как нокдаун RUNX1 / RUNX1T1 устраняет пропуск экзона 4, истощение SRSF7 имеет противоположный эффект. Напротив, нокдаун RBFOX2 не влияет на пропуск экзона 4 (дополнительный рис. 6h, i). Эти комбинированные данные подтверждают, что RUNX1 / RUNXT1 нарушает сплайсинг, вмешиваясь в функцию SRSF7.

Наконец, чтобы оценить участие факторов наблюдения РНК в дифференциальном сплайсинге, мы сравнили распределение экспрессии изоформ РНК с кодонами преждевременной терминации трансляции и без них для всех генов с дифференциальным сплайсингом.Этот анализ не выявил значительных различий между двумя пулами молекул РНК: около 11% изоформ РНК с дифференциальным сплайсингом содержат преждевременные стоп-кодоны по сравнению с 14% изоформ недифференциальной РНК (отношение шансов 0,81, p -значение = 0,470 согласно к точному тесту Фишера).

Взятые вместе, эти находки подтверждают, что помимо регуляции дифференциального сплайсинга посредством прямого связывания и изменения структуры хроматина, RUNX1 / RUNX1T1 нарушает регуляцию этого процесса, изменяя экспрессию факторов сплайсинга.

RUNX1 / RUNX1T1 регулирует альтернативный сплайсинг

PTK2B через RBFOX2

Ген PTK2B (также известный как PYK2) кодирует киназу фокальной адгезии 2B, которая регулирует клеточную адгезию и миграцию, два ключевых процесса в лейке. . Высокие уровни экспрессии этого гена указывают на плохой клинический исход (дополнительный рис. 7a). Ген подлежит альтернативному сплайсингу: дифференциальный сплайсинг экзона 23 приводит к двум изоформам белка из 1009 и 967 аминокислот, причем более короткая из них не имеет области ядерной / цитоплазматической локализации между киназой и C-концевым доменом, нацеленным на фокальную адгезию (рис. .10а) 59 . Анализ возникающих и общих данных РНК-Seq из клеток Kasumi-1 показал, что нокдаун RUNX1 / RUNX1T1 ведет к увеличению пропусков экзона 23 и сопутствующему присоединению экзона 22 к экзону 24 (Рис. 10b-d). Хотя RUNX1 / RUNX1T1 занимает локус PTK2B в нескольких сайтах, образование этого альтернативного соединения J26 вряд ли напрямую регулируется слитым белком, поскольку его ближайший сайт связывания расположен более чем на 35 т.п. .Поскольку потеря связывания RUNX1 / RUNX1T1 также была связана с более чем двукратным снижением экспрессии RBFOX2 (рис. 9a), мы исследовали потенциал этого регулятора альтернативного сплайсинга в удержании экзона 23. Анализ TGCA-LAML и Наборы данных GEO / ENA-AML установили отрицательную корреляцию между экспрессией RBFOX2 и пропуском экзона 23 (рис. 10e; дополнительный рис. 7b, c). Примечательно, что консенсусный сайт UGCAUG для связывания RBFOX2 расположен всего в 12 нуклеотидах ниже этого экзона, и оценка данных ENCODE eCLIP для линии клеток CML K562 выявила прямую ассоциацию RBFOX2 с экзоном 23 PTK2B (рис.10f).

Рис. 10: RUNX1 / RUNX1T1 контролирует альтернативный сплайсинг транскриптов PTK2B в t (8; 21) -положительных лейкозных клетках.

a Графики сплайсинга, репрезентативные транскрипты, собранные запонками, и in silico транслируемые белки гена PTK2B . Эта панель основана на данных общей РНК-Seq Касуми-1. Экзоны и соединения экзон-экзон обозначены буквами E и J соответственно и пронумерованы. Дифференциально используемое соединение J26 выделено фиолетовым цветом.Для каждого транскрипта, основанный на Cuffdiff log 2 -кратных изменений экспрессии и соответствующие значения q указаны в скобках. обозначает аминокислоты. b Стрип-диаграммы, демонстрирующие нормализованную экспрессию экзон-экзонных переходов J24-J27 в клетках Касуми-1. Расположение соединений в геноме показано в и . Горизонтальные линии — это средние арифметические значения. P Значение было рассчитано с помощью двустороннего критерия t Стьюдента. c и d Проверка на основе кПЦР дифференциального сплайсинга транскриптов PTK2B в двух условиях обработки миРНК.Положения связывания праймеров и структура ожидаемых ампликонов показаны в c . Столбцы в d представляют собой среднее значение двух независимых экспериментов qPCR. и корреляционная тепловая карта Пирсона, демонстрирующая взаимосвязь между экспрессией генов SRSF7 , RBFOX2 или PTK2 и событиями сплайсинга в гене PTK2B . Эта карта основана на наборе данных TCGA-LAML ( n = 173). f Белки RBFOX2 и SRSF7 связывают ген PTK2B .Этот снимок браузера генома основан на данных ENCODE eCLIP. г Влияние siRNA-опосредованного нокдауна экспрессии RBFOX2 и SRSF7 на сплайсинг гена PTK2B в клетках Касуми-1. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов.

Для более непосредственного изучения влияния RBFOX2 на пропуск экзона 23 мы изменили экспрессию RBFOX2 с помощью двух независимых миРНК. Либо siRNA, достигнутая при снижении уровней RBFOX2 в 2,5-4 раза, такое же снижение, как при нокдауне RUNX1 / RUNX1T1 (дополнительный рис.7г). Эта потеря RBFOX2 привела к трехкратному уменьшению удерживания экзона 23 снова, аналогичному тому, которое достигается за счет истощения слитого белка (фиг. 10g, верхняя панель). Примечательно, что нокдаун SRSF7 не влиял на удержание экзона 23 (фиг. 10g, нижняя панель). Эти объединенные данные показывают, что RUNX1 / RUNX1T1 влияет на альтернативный сплайсинг PTK2, модулируя экспрессию RBFOX2.

Снижение активности НАДФН-оксидазы улучшает сердечно-сосудистый фенотип на мышиной модели синдрома Вильямса-Бойрена

Фигура 2.

Сердечно-сосудистые особенности, система angII / Ren и параметры окислительного стресса у мышей дикого типа, DD и DD / Ncf1- .

(A) Среднее артериальное давление у 16-недельных мышей в сознании. Мыши DD показали значительно повышенное среднее кровяное давление по сравнению с однопометниками дикого типа ( P <0,001). Значения были снижены у животных DD / Ncf1- по отношению к DD и существенно не отличались от однопометников дикого типа.(B) Уровни AngII в плазме также были значительно повышены у мышей DD по сравнению с однопометниками дикого типа ( P <0,001) и частично снижены у DD / Ncf1- животных ( P = 0,002 / P = 0,036. , по сравнению с мышами дикого типа и мышами DD соответственно). (C) Относительные уровни транскриптов Ace , Agt и Ren в мРНК сердца от каждого генотипа. Данные были нормализованы таким образом, чтобы среднее значение для группы дикого типа было 1,0, представленное синей линией.(D) Относительная масса сердца по отношению к массе тела у вскрытых 16-недельных мышей. Мыши DD демонстрировали значительно увеличенные сердца по сравнению с мышами дикого типа ( P <0,001). Относительный вес сердца был на ~ 20% меньше у DD / Ncf1- по сравнению с DD ( P = 0,039). (E) Средний размер артериальной стенки в восходящей аорте различных групп животных. Толщина артериальной стенки была значительно меньше у мышей DD / Ncf1- по сравнению с мышами DD. (F) Количественная оценка параметров окислительного стресса, выраженных в произвольных единицах флуоресценции.Значительно более высокие уровни нитрозилирования белка ( P <0,001) и общая продукция ROS ( P <0,001) были обнаружены у мышей DD по сравнению с однопометными мышами дикого типа и DD / Ncf1-. * P <0,05 по сравнению с дикого типа; # P <0,05 по сравнению с мышами DD. Результаты представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (n = 7–12 на группу или n = 3–4 на анализ окислительного стресса).

Подробнее »

Адам Кертис все объясняет

В феврале 1967 года Джим Гаррисон, окружной прокурор Нового Орлеана, написал меморандум на пяти страницах под названием «Время и предрасположенность: факторы фазы I», в котором раскрыты некоторые из ложных связей, которые он установил. в своей попытке обрисовать то, что, по его мнению, было истинной сущностью убийства президента Джона Ф.Кеннеди. Гаррисон считал, что лучший способ раскрыть хорошо скрытые заговоры — это замечать кажущиеся совпадения — когда два человека оказались в нескольких кварталах друг от друга или когда кто-то проехал за углом из-за угла, откуда был изъят тайник с героином, — и собирать шаблон из получившегося болота имен, адресов и дат. Несколько лет назад британский кинорежиссер Адам Кертис наткнулся на меморандум Гаррисона в книге «Шутник и заговор», написанной автором журнала и самозваным историком Адамом Горайтли.В то время Кертис пытался понять политический раскол и безудержную дезинформацию, сопровождавшую избрание Дональда Трампа и, в его собственной стране, голосование по Брекситу. «Обычно я ненавижу теории заговора. Я считаю их скучными, — сказал мне недавно Кертис. «Потом я наткнулся на« Time and Propinquity »и подумал:« Да ». . . . Фрагменты. Так думают сейчас люди. Они создают ассоциации, и в этом нет никакого смысла. Это мир, в котором мы живем ».

Кертис представляет Гаррисона ближе к концу первого часа своего нового сериала из шести фильмов «Не могу выкинуть из головы: эмоциональная история современного мира», который будет выпущен BBC на 11 февраля.(Фильмы Кертиса, как правило, появляются на YouTube в течение нескольких дней после их первоначальной трансляции, загруженной фанатами.) Семьдесят второй раздел фильма, разъясняющий концепцию времени и близости, включает архивные кадры (и это неполный список) Американские машины проезжают по подземному переходу; горящие уличные фонари; двое мужчин в пышных костюмах, лица которых не в кадре, курят сигары и пьют виски, сидя на садовой мебели на балконе многоэтажного дома; мужчины в темных очках, ненадолго прерывающиеся, чтобы завязать разговор возле заправочной станции; руки разбирают прослушиваемый телефон; конфискованный блестящий пистолет; Борт номер один; молодой человек достает книгу из картотеки; автобус, освещенный солнечным светом сбоку; вид прямо на небоскреб; вертолет, пролетавший над людьми на крыше опаленного огнем многоквартирного дома; мужчина в красной футболке в офисе ночью; тело на полу рядом со столом; женщина в темных очках в автобусе; автомобиль, подъезжающий к аэропорту; вертолет с прожектором, сияющим в темноте; и Mercedes-Benz приближается к пункту взимания платы.Образы полны ощущения времени и места, но при этом они не соответствуют времени и месту. Единственный контекст — это голос Кертиса, ровно говорящий поверх игрового процесса. «Эта теория должна была иметь очень мощный эффект в будущем, потому что она приведет к глубокому сдвигу в том, как многие люди понимают мир», — говорит он. «Потому что там говорилось, что в темном мире скрытой силы нельзя было ожидать, что все будет иметь смысл, что бессмысленно пытаться понять смысл того, почему что-то произошло, потому что это всегда будет скрыто.Вы искали шаблоны ».

Эта сцена прекрасна и мрачна и может появиться только в фильме Адама Кертиса или в пародии на него. Более тридцати лет Кертис предпринимал смелые галлюцинаторные попытки объяснить современные массовые затруднения, такие как истоки послевоенного индивидуализма, войны на Ближнем Востоке и наше отношение к самой реальности. Он описывает свои фильмы как комбинацию двух иногда противоречащих друг другу элементов: поток необычных, вызывающих воспоминания образов из прошлого, богато украшенных поп-музыкой, которые накладываются на его собственный, откровенно поставленный, часто неподдающийся проверке анализ.Он стремится вызвать «сложность мира».

Кертис, которому шестьдесят пять лет, отвергает любые разговоры об искусстве в связи с этой работой. Он описывает себя как тележурналиста. Частично его настойчивость проистекает из особого отвращения английского среднего класса к тому, чтобы быть ошибочно принятой за интеллектуала, но остальная часть проистекает из утверждения Кертиса о том, что его фильмы более точно отражают современную жизнь и общество, чем это удается в большинстве прямых репортажей. «Я по сути эмоциональный журналист, — сказал Кертис.«Настроение, которое создают мои фильмы — и, возможно, причина, по которой людям нравится такое настроение, — в том, что оно каким-то образом кажется реальным, даже если оно кажется мечтательным и странным. Он действительно понимает то, что происходит в головах людей, что в некотором роде и есть реализм. Люди в девятнадцатом веке думали и чувствовали не так, как мы сегодня ».

Кертис работал на BBC с начала восьмидесятых. Его фильмы получили четыре награды BAFTA . Он является одним из ведущих британских режиссеров научной литературы, но его точный статус трудно определить.В названии должности Кертиса указано, что он является исполнительным продюсером BBC Three, цифрового канала корпорации, который специализируется на документальных фильмах и комедии и ориентирован в первую очередь на молодых зрителей. В его электронной почте написано, что он работает в «Текущих делах». По правде говоря, Кертис — разрозненная частица внутри организации, имеющая исключительную лицензию на изучение и экспериментирование с архивом телеканалов BBC за последние семьдесят четыре года, который может быть крупнейшим в мире. С 2015 года Кертис выпускает свои фильмы непосредственно в Интернете через iPlayer BBC, что освободило его от определенных редакционных ограничений (фильмы Кертиса со временем стали длиннее и разнообразнее), а также позволило ему занять нишу, но глобально, следуя за онлайн.«Я обнаружил, что, если вы не просите много денег, BBC будет меньше беспокоиться о вас», — сказал он. Бюджет фильма Кертиса «Гипернормализация» 2016 года составлял около восьмидесяти тысяч долларов.

Не любит, когда его называют художником, но ведет себя как художник. В последние годы Кертис также работал над проектами с Punchdrunk, труппой иммерсивного театра; Massive Attack, британская трип-хоп группа; и Чарли Брукер, создатель «Черного зеркала». Пока Кертис редактировал «Не могу вытащить тебя из головы», он работал один в таунхаусе в Сохо, Лондон, который принадлежит другу, который является галеристом.Когда я зашел однажды днем ​​в конце октября, Кертис открыл дверь в оливково-зеленом анораке. У него белые вьющиеся волосы. С момента нашей предыдущей встречи в центре узкого мрачного вестибюля материализовалась металлическая колонна чуть выше пояса. Кертис, извиняясь, прокрался обратно в здание мимо скульптуры. «Не спрашивай, — сказал он. «Это», — он сделал паузу для эффекта, — «работа».

Кертису писать намного сложнее, чем то, что он называет «резкой архива», что он делает быстро и без особых усилий.Он устроил свой первый офис в доме в скудно обставленной столовой, обшитой деревянными панелями, надеясь, что ее аскетизм поможет ему писать. Затем он переехал в более удобную комнату. К концу осени он работал за настольным компьютером, установленным на кухонном столе, с множеством внешних жестких дисков и обогревателем на полу. В тот день Кертис боролся с введением в серию, которая длится около восьми часов и охватывает научные проекты Британской империи девятнадцатого века и катастрофу подводной лодки «Курск» под Баренцевым морем в 2000 году и далее до нашей эры. настоящие бедствия.«Очень сложно передать всю широту того, что я делаю», — сказал он. «Часть меня хочет быть действительно радикальной и просто начать как роман. Но я думаю, что это, наверное, неправильно. На данный момент все, что было у Кертиса, — это титульная карточка и подпись, написанная шрифтом Arial, который он предпочитает, со словами: «ВОССТАНОВЛЕНИЕ МИРА БЕЗ ЗНАЧЕНИЯ».

«Не могу выкинуть тебя из головы» выросло из реакции Кертиса на популистские мятежи 2016 года. Кертис был поражен яростью основных либералов и одновременным отсутствием у них значимого видения будущего, которое могло бы противостоять интуиции. призыв национализма и ксенофобии.«У тех, кто был против всего этого, на самом деле не было альтернативы», — сказал он.

Кертис пришел к выводу, что мировоззрение правящих элит всех мастей — среди американского политического истеблишмента, в России и Китае, в аналитических центрах и в Европейском союзе, международных банках и технологических компаниях — это попытка управлять миром, не преобразуя его. Это. После жестокости и социальных экспериментов двадцатого века имело смысл отказаться от великих идеологий, но в результате мы живем в обществах, лишенных повествовательной последовательности, где кипят старые мифы.«Нет ничего особенного, — сказал Кертис. «И это верно не только для Китая, но и для Китая. Все просто пытаются управлять настоящим и отчаянно удерживать его стабильным, почти как в постоянном настоящем, а не шагать в будущее. И я не думаю, что это продлится долго. . . . Потому что, если у вас есть история о том, куда вы идете, когда обрушиваются катастрофы, такие как 9/11 или COVID или банковский кризис, они позволяют вам поместить их — даже если они пугающие — заставить их чувство меры.Если у вас нет истории о том, куда вы собираетесь, они кажутся ужасающими случайными действиями из другой вселенной ». В разговоре Кертис иногда говорит все быстрее и быстрее, как в киноверсии математического гения, покрывая доску уравнениями, пока он не приходит, не торжествующе, но, тем не менее, окончательно, к ответу. Каждый из его проектов основан на единственной провокационной идее, и цель его новой серии состоит в том, что мы стали неспособны вообразить будущее — мы — граждане вечного настоящего, сдерживаемого сомнительными технологиями, пустыми политиками и катастрофическим самоуничтожением. сомневаться.«ЕСЛИ ВАМ ЭТО НРАВИТСЯ», — бегите по подписи к кадрам молодого Барака Обамы, — «ВАМ ЭТО ПОНРАВИТСЯ». Входит Джо Байден, машет сторонникам на рядах экранов. «Я верю только в прогресс», — сказал мне Кертис. «И на данный момент мы каким-то образом создали мир, в котором он словно остановился. Это как бы вне времени.

Как рассказчик, Кертиса привлекают либо революционеры, которые хотят изменить мир, либо инженеры, которые планируют стабилизировать человеческое общество и управлять им с помощью машин.(Обычно он встает на сторону революционеров, хотя и признает, что они часто ошибаются.) «Решающим фактором является борьба между этими двумя вещами», — сказал мне Кертис. «Это то, о чем все мои фильмы». В своей новой работе Кертис искал менее схематичный подход, стремясь изобразить не только идеологов и строителей систем, но и людей, которых поражает то, что происходит вокруг них. «Этот более эмоциональный, более захватывающий», — сказал он.

Среди примерно дюжины других Кертис следует за такими фигурами, как Майкл де Фрейтас — карибский мигрант в Западный Лондон, который в семидесятых стал сборщиком ренты, а затем Майкл Икс, чернокожий лидер власти, повешенный за убийство, — помещая свою историю рядом с взлет и падение Цзян Цин, жены Мао Цзэдуна и вдохновляющей фигуры Культурной революции, а также идеи Мюррея Гелл-Манна, физика, который ввел термин «кварк» и популяризировал «теорию сложности» как способ понимание мира природы.Кертис сопоставляет жизни и умы Тупака Шакура и Абу Зубайды, джихадиста саудовского происхождения с черепно-мозговой травмой, который подвергся пыткам ЦРУ. после 11 сентября и начал рассказывать воображаемые террористические заговоры из фильмов-катастроф, которые он видел. «Я всегда стремился снимать фильмы о людях, у которых есть идеи о том, как вы можете что-то делать и как эти идеи затем воплощаются в жизнь», — сказал Кертис. «То, что я хотел сделать в этом, было чем-то, в котором вы смешивали таких персонажей, но у вас также были персонажи, на которых действуют эти идеи, и они попадают в их головы, а затем они мутируют и выходят как что-то еще.

Кертис говорит, что работает как любой другой журналист: люди и идеи захватывают его; он тратит время на TikTok, который ему очень нравится; он ходит по библиотекам. Но он также проводит необычно много времени, позволяя разматывать старые кадры на экране. В главном архиве Би-би-си в Перивале, где насчитывается шестьдесят миль полок, Кертис заказывает не только новости о восстании Мау-Мау в Кении, находящейся под властью Великобритании, но и целые ночные бюллетени или что-нибудь еще, снятое в этом регионе во время войны. тот же период.Он выискивает странные ключевые слова, не каталогизированные фильмы. Он жаждет невидимого. «Не знаю, играете ли вы в компьютерные игры. Но это как подняться на уровень выше, — сказал он мне. «Есть вещи, которые доступны каждому. Затем материал, который не был оцифрован, или что-то еще, что все еще находится на пленке, и я могу это получить. Кроме того, есть действительно странные записи ».

Есть необработанная лента новостей BBC, например, сброшенная спутниками по всему миру в восьмидесятые годы, называемая лентой COMP .Кертис наблюдает большую часть того, что находит, при быстрой перемотке вперед, пролистывая файлы QuickTime. Он позволяет себе отвлечься. «Это похоже на шоппинг», — сказал он. «Просто пройди через это». Кертис узнал о де Фрейтасе, предмете эссе В. С. Найпола, когда он блуждал по пленкам конца шестидесятых. В кадре де Фрейтас, уравновешенный, бородатый, одетый в черный костюм и галстук, с расстегнутой верхней пуговицей рубашки, описывает свое первоначальное недоверие к расизму, с которым он столкнулся в Великобритании после своего патриотического колониального воспитания в Тринидаде.«Кто-то вопреки надежде надеялся, что увиденное было неправильным», — говорит де Фрейтас. Кертис нашел в интервью все увлекательным, от покровительственных уговоров интервьюера BBC до осведомленности и остроты злобы де Фрейтаса. «В этом фильме вы видите корни настоящего, — сказал Кертис. «И вы думаете, о, тогда все было намного сложнее, чем мы думаем».

IJMS | Бесплатный полнотекстовый | Транскриптомика при болезни Альцгеймера: аспекты и проблемы

Дифференциально экспрессируемые гены (ДЭГ) являются важными мишенями в открытии биологических путей, участвующих в различных заболеваниях, таких как рак или неврологические заболевания.Цель анализа DEG — найти гены, которые могут быть активированы или подавлены при заболевании по сравнению с неповрежденными контролями. Чрезмерная или недостаточная экспрессия различных генов может приводить к изменениям метаболических, иммунных и других путей, что приводит к заболеваниям [15,16]. ДЭГ также могут влиять на возникновение нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера. Кроме того, возможны вариации между паттернами экспрессии генов в разных областях мозга [17]. Важно выяснить, могут ли изменения транскрипции привести к аддитивным эффектам в известных факторах риска заболевания и путях, связанных с заболеванием.Возникновение БА может увеличиваться с возрастом, а аномальные изменения транскрипции приводят к возникновению механизмов, связанных с заболеванием [18,19]. Анализ экспрессии отдельных клеток показал, что несколько генов могут быть связаны с патологией нейрофибриллярного клубка. DEG сравнивали в нейронах AD-NFT, нейронах AD-non-NFT и нормальных нейронах без NFT. Экспрессия казеинкиназы 2, бета-полипептида (CSNK2B), аполипопротеина J (APOJ) и тканевого ингибитора металлопротеиназы 3 (TIMP3) киназы 1, связанной с рецептором интерлейкина-1 (IRAK1), активировалась как в AD-NFT, так и в AD-non- NFT нейроны по сравнению с нормальными нейронами.Кроме того, их экспрессия была выше в нейронах AD-NFT по сравнению с нейронами AD-non-NFT. Экспрессия кальпаина 7 (CAPN7) подавлялась в нейронах AD, как с патологией NFT, так и без патологии NFT [20]. Полный анализ транскриптома был выполнен Antonnel et al. (2013), которые сравнили альтернативную экспрессию случаев EOAD с мутациями PSEN1 и без них. Это исследование не обнаружило каких-либо существенных различий между DEG-паттерном у PSEN1-положительных и PSEN1-отрицательных случаев EOAD [21]. Однако несколько генов по-разному экспрессировались в контрольной группе и в случаях EOAD (с мутацией или без).DEGs участвуют в нескольких механизмах, включая путь передачи сигналов кальция, взаимодействие нейроактивного лиганда с рецептором, передачу сигналов тау-белка, ассоциированного с микротрубочками (MAPT), долгосрочную потенциацию или управление аксонами [21]. Canchi et al. (2019) сравнили паттерн экспрессии у 414 пациентов с БА и здоровых людей. Они объединили специфические взаимодействия мозга и ткани мозга с генными сетями и обнаружили различные кластеры генов, уровни экспрессии которых могут изменяться при БА [22]. Эти кластеры включают синаптическую передачу (нейрегулин 1, NRG1; гамма-аминомасляная кислота, GABA; рецептор лизофосфатидной кислоты 1, LPAR), репарацию и транскрипцию ДНК (компонент 7 комплекса поддержания минихромосом, MCM7; тирозил-ДНК-фосфодиэстераза 1, TDP-1; DEK-прото-диэстераза 1, TDP-1; Онкоген, DEK), иммунный ответ (TYROBP, CXCR4, SOCS3), не охарактеризованные кандидаты (Rho GTP-азы, факторы риболсилирования АДФ) и метаболические факторы (Dynamin 1 Like, DNM1L; член семейства HIG1, индуцируемый гипоксией домен 1A, HIGD1A; цитохром C Фактор сборки оксидазы гем А: фарнезилтрансфераза, COX10).Анализ обогащения генов показал, что четыре мишени были обогащены и дифференциально экспрессировались во всех кластерах, включая фактор транскрипции Sp1 (SP1), ответ раннего роста 3 (EGR3), фактор, индуцированный TGFB Homeobox 1 (TGIF1), фактор транскрипции пальца PHD бромодомена (BPTF). Связи между EGR3 и AD пока не обнаружено. Подавление EGR3 может играть роль в дисфункциях цикла синаптических пузырьков. EGR3 может напрямую взаимодействовать с VGF, индуцируемым фактором роста нервов (VGF) и H + -АТФазой вакуолярного типа (V-ATPASE), и нарушение этого пути может влиять на экспрессию различных генов, таких как протеин, связанный с синаптосомами 25 (SNAP25), Clathrin Heavy Chain (CLTC), что приводит к уменьшению стыковки и рециклинга везикул соответственно [22].Многоуровневое исследование Morabito et al. (2019) в разных наборах данных о мозге выявили специфические транскриптомные сигнатуры AD. Были подавлены некоторые пути, такие как убиквитинирование, митохондриальные функции и синаптическая передача. Иммуноассоциированные глиальные модули и сигнальный преобразователь / активатор сигнала транскрипции Янус-киназа (JAK) (JAK / STAT) и передача сигналов митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) активируются при БА [23]. Это исследование также обнаружило изменение в экспрессии длинных некодирующих РНК [23].Секвенирование полного транскриптома в гиппокампе van Rooij et al. (2019) выявили 2716 DEG, из которых 735 были сгруппированы в 33 модуля по терминам биологического процесса генной онтологии (GOBP) [24]. Эти модули могут участвовать в передаче сигналов, транспорте или клеточном метаболизме. ДЭГ также включали 2 известных гена риска БА: фактор-усилитель миоцитов 2C (MEF2C) и протеин-тирозинкиназу 2-бета (PTK2B). Однако модули обнаружения могут также взаимодействовать с несколькими генами риска БА, включая (основной комплекс гистосовместимости, класс II, DR Beta 1/5) HLA-DRB1 / HLA-DRB5, мостовой интегратор 1 (BIN1), PICALM (эндоцитоз и передача сигналов). , ABCA7 и MAPT (перенос ионов), APP (передача сигнала) или CLU (экзоцитоз) [24].Анализ транскриптома отдельных клеток, выполненный Mathys et al. проанализировали различные типы клеток в посмертном мозге пациентов с БА, включая возбуждающие нейроны, олигодендроциты, микроглию, эндотелиальные клетки или перициты. Это исследование обнаружило 1031 градус в нервных клетках по сравнению с мозгом пациентов и здоровых людей. Большинство ДЭГ были связаны с клеточными процессами. Нарушения экспрессии генов, связанных с миелинизацией, были обнаружены во всех типах клеток, особенно в олигодендроцитах и ​​их клетках-предшественниках.Несколько генов представили критические изменения в экспрессии генов, такие как лейцин-богатый повтор и домен Ig, содержащий 1 (LINGO1), белок, взаимодействующий с Erbb2 (ERBB2IP), белок, связанный с контактином 2 (CNTNAP2), регулятор роста нейронов 1 (NEGR1), экспрессия X- в мозге. Связанный 1 (BEX1) или Netrin G1 (NTNG1). На ранних стадиях заболевания более клеточно-специфичные, но регулируемые изменения экспрессии и гены, связанные со стрессовой реакцией и поддержанием гомеостаза, соответственно, стали более распространенными для всех типов клеток.Наблюдались различия между пациентами мужского и женского пола в паттернах экспрессии, особенно в нейронах и олигодендроцитах. У мужчин амилоидная патология была связана с активацией олигодендроцитов, в то время как у женщин подавление активности было обнаружено в возбуждающих и тормозных нейронах [25].

Codename Enterprises, Inc. против Fremantlemedia North America, 1: 16-cv-01267 — CourtListener.com

ДЕКЛАРАЦИЯ Майкла Эрреры в поддержку дела: 90 ДВИЖЕНИЕ для суммарного судебного решения.. Документ, поданный Fremantlemedia North America, Inc. (Приложения: № 1 Приложение QQ — Журнал прав ответчика, № 2 Приложение RRa — Выдержка из отчета о поиске товарных знаков Corsearchs, № 3 Приложение RRb, № 4 Приложение SSa — Выдержки из Декларации Майкла Бузински, № 5, экспонат SSb, № 6, экспонат SSc, № 7, экспонат SSd, № 8, экспонат SSe, № 9, экспонат TTa — выдержки из декларации Кристофера Бренчли, № 10, экспонат TTb, № 11, экспонат UUa — стенограмма Уильяма Тоуэлла, № 12 Exhibit UUb, # 13 Exhibit UUc, # 14 Exhibit UUd, # 15 Exhibit VVa — Стенограмма Мэтью Флетчера, # 16 Exhibit VVb, # 17 Exhibit VVc, # 18 Exhibit VVd, # 19 Exhibit VVe, # 20 Exhibit VVf, # 21 Exhibit VVg, # 22 Exhibit VVh, # 23 Exhibit VVi, # 24 Exhibit VVj, # 25 Exhibit VVk, # 26 Exhibit VVl, # 27 Exhibit VVm, # 28 Exhibit VVn, # 29 Exhibit VVo, # 30 Exhibit WWa — Выдержки из PAGEBUZZ , № 31 Exhibit WWb, № 32 Exhibit WWc, № 33 Exhibit WWd, № 34 Exhibit WWe, № 35 Exhibit XX — Заявки на регистрацию товарных знаков для BUZZR (сер.№№ 86/451 967 и 86/573 422), BUZZR TV (серийные номера 86/573 432 и 86/573 439), BUZZR LETS PLAY & Design (серийные номера 86/651 657, 86/651 666, 86/651 669 и 86 / 651,671) и BUZZR CASINO & Design (сер. № 86 / 748,171), № 36, Приложение YY — свидетельство о регистрации товарного знака для BUZZR (Рег. № 5,134,173), № 37, Приложение ZZa — стенограмма Джеффри Фогеле, № 38. ZZb, № 39 Приложение AAAa — Стенограмма Дэвида Уинслоу, Приложение № 40 AAAb, № 41 Приложение AAAc, № 42 Приложение BBB — Стенограмма продаж Дэвида, № 43 Приложение CCC — Свидетельство о регистрации и свидетельство использования товарного знака BUZZ (рег.№ 2,864,807), № 44 Приложение DDD — Свидетельство о регистрации и свидетельство использования товарного знака BUZZ (Рег. № 3 325 673), Приложение № 45 EEE — Свидетельства о регистрации и свидетельство использования товарного знака BUZZ (Рег. № 3 720 041 и 3,754,769), № 46 Приложение FFF — Свидетельство о регистрации и свидетельство использования товарного знака BUZZ (рег. № 3781732), № 47 Приложение GGG — Свидетельство о регистрации и свидетельство использования товарного знака BUZZAAR (Рег. № 4 468 436), № 48 Приложение HHH — Свидетельства о регистрации и свидетельства использования товарных знаков BUZZD и BUZZD & Design (рег.№ 3 578 709 и 3 578 712), № 49 Приложение III — Свидетельство о регистрации и свидетельство использования товарного знака BUZZIN (Рег. № 3 775 518), № 50 Приложение JJJ — Свидетельство о регистрации и свидетельство использования товарного знака BUZZREADS (Рег. 4,600,028), № 51 Приложение KKK — Экспертное раскрытие истцов в соответствии с Федеральным законом. R. Civ. Стр. 26 (a) (2) (A) в сопровождении экспертного заключения Милина Ю. Шаха, № 52 Приложение LLL — Второй набор допросов истцов, № 53 Приложение MMM — Выдержки с веб-сайтов с BOOK BUZZR, № 54 Exhibit NNN — Выдержки веб-сайтов с BUZZ ADVERTISING, № 55 Exhibit OOO — Выдержки веб-сайтов с BUZZ BRANDING, № 56 Exhibit PPP — Выдержки веб-сайтов с BUZZ INTERNET SOLUTIONS, № 57 Exhibit QQQ — Выдержки веб-сайтов с BUZZ WEBSITES, № 58 Exhibit RRR — Выдержки веб-сайтов с BUZZER, № 59 Exhibit SSS — Выдержки веб-сайтов с BEZZERANA, № 60 Exhibit TTT — Выдержки веб-сайтов с BUZZERATI, № 61 Exhibit UUU — Свидетельство о регистрации и свидетельство использования товарного знака BUZZFEED (рег.№№ 3,367,020 и 4,600,026) (Карри, Джеймс) (Дата поступления: 10.03.2017)

A Молекулярный анализ Na + -независимых катионно-хлоридных котранспортеров Академическая исследовательская работа по «Биологическим наукам»

DOI: 10.1159 / 000356621

и издательство Biochemistry pub

Принята к печати: 23 ноября 2013 г.

© 2013 С.KargerAG, Базель www.karger.com/cpb

1421-9778 / 13 / 0327-0014S38.00 / 0

Karger Openaccess

Это статья в открытом доступе под лицензией Creative Commons Attribution-Noncommercial 3.0 Unported (CC BY-NC) (www.karger.com/OA-license), применимой только к онлайн-версии статьи. Распространение разрешено только в некоммерческих целях.

Обзор

Молекулярный анализ Na + -независимых котранспортеров хлоридов катионов

Кеннет Б.Gagnon3 Маурисио Ди Фульвиоб

a Кафедра анатомии и клеточной биологии, Университет Саскачевана, Саскатун, Южная Каролина, Канада; b Кафедра фармакологии и токсикологии, Государственный университет Райта, Медицинская школа Буншофт, Дейтон, Огайо, США

Ключевые слова

SLC12A • Варианты • Ген • Объем • Положение

Аннотация

Гомологичные гены, кодирующие семейство электронейтральных переносчиков растворенных веществ 12A (SLC12A), были идентифицированы более 20 лет назад, однако за последние несколько лет стало ясно, что каждый из генов этого семейства потенциально кодирует более одного катиона — котранспортер хлорида (CCC).Что еще более удивительно, несмотря на более чем 30-летние функциональные исследования и обширные знания об активаторах, ингибиторах, ионном сродстве и кинетике этих котранспортеров, мы все еще не можем в достаточной степени объяснить, почему одни клетки экспрессируют только одну изоформу CCC, а другие — две. , три или более изоформ CCC. В 2009 г. Альварес-Лифманс и Ди Фульвио опубликовали обширный молекулярный анализ in silico потенциальных вариантов сплайсинга Na + -зависимых катион-хлоридных котранспортеров.В этом обзоре мы рассмотрим исключительно большое разнообразие потенциальных вариантов сплайсинга в пределах Na + -независимых катион-хлоридных котранспортеров (SLC12A4-SLC12A7) генов, их исходную тканевую идентификацию и их физиологическое значение.

Авторские права © 2013 S. KargerAG, Базель

Введение

Транспортное семейство электронейтральных переносчиков растворенных веществ 12A [SLC12A) включает по меньшей мере семь ветвей гомологичных генов: i.S

Medicine, 3640 Colonel Glenn Hwy, 216 HSB, Dayton, OH 45435 (США) Тел. +1937 775-5250, факс +1937 775-7221, электронная почта [email protected]

DOI: 10.1159 / 000356621

и издательство «Биохимия»: 8 декабря 2013 г.

Ганьон / Ди Фульвио: молекулярный анализ котранспортеров K-CI

Гены

, SLC12A8 (катионно-хлоридный котранспортер 9, CCC9) и SLC12A9 (катионно-хлоридный котранспортер-взаимодействующий белок 1, CIP1) также были предложены как часть семейства SLC12A на основе относительно слабой (~ 20%) аминокислоты идентичность последовательностей CCC9 / CIP1 и других членов семейства SLC12A.В самом деле, общее эволюционное происхождение и включение CCC9 / CIP1 в семейство SLC12A должно быть выведено из функциональных данных или общих структур, предсказанных in silico [1]. Интересно, что CCC9 транспортирует полиамины чувствительным к фуросемиду, зависимым от аминокислот и Na + / K + / Cl «-независимым способом [2], тогда как CIP1 не связан с котранспортом Na +, K + или CI», но имеет общие предсказанные структурные особенности. с членами семейства SLC12A и способен взаимодействовать и потенциально ингибировать функцию котранспортера Na-K-2C1 (NKCC1) [3].семья. Каждый из этих котранспортеров участвует в электронейтральном накоплении CI, «используя энергию, запасенную в комбинированных химических градиентах Na +, K + и CI» [обзор в [4]]. Недавно был опубликован обширный анализ in silico потенциальных вариантов сплайсинга Na + -зависимых катион-хлоридных котранспортеров (SLC12A1-SLC12A3) [1]. Поэтому в этом обзоре мы сосредоточимся на потенциальных вариантах сплайсинга внутри Na + -независимых катион-хлоридных котранспортеров и функциональных последствиях мультиизоформной экспрессии этих транспортных белков в различных типах клеток.

Белковые продукты генов SLC12A4-SLC12A7, широко известные как котранспортеры K-Cl, также участвуют в регуляции объема клеток, однако, как экструдеры CI «, они поддерживают концентрацию внутриклеточного хлорида ([CI»].] Ниже уровня значения, предсказанные термодинамическим равновесием. В нормальных физиологических условиях движущая сила для каждого из этих котранспортеров K-Cl для вытеснения CI «из клеток исходит из химической энергии, полученной из направленного наружу дифференциального градиента концентрации K + через клеточную мембрану [1, 5 ].Фактически, только небольшой сдвиг во внеклеточной концентрации K + может привести к обращению от «экструзии CI к накоплению CI» [6].

На фармакологическом уровне каждый из котранспортеров K-Cl (KCC1-KCC4) ингибируется относительно высокими концентрациями диуретиков буметанида или фуросемида [7, 8]. Кроме того, некоторые неспецифические препараты, такие как 4, 4 ‘ -диизотиоциано-2, 2’-стильбен-дисульфоновая кислота (DIDS) или дигидроинденилоксиуксусная кислота (DIOA] [9-11], как сообщается, также ингибируют активность KCC [12, 13].Хотя не существует специфических лекарств, способных блокировать активность KCC1 и KCC4, недавно были охарактеризованы и оптимизированы новые высокоселективные и специфические ингибиторы KCC2 и KCC3 [14,15].

При анализе in silico предсказанные аминокислотные последовательности KCCs показывают потенциал для принятия сходных топологий, состоящих из 12 трансмембранных доменов, фланкированных двумя большими внутриклеточными N- и C-концами [16-20]. Для большинства членов семейства SLC12A функциональные свойства этих котранспортеров были тщательно изучены в гетерологичных системах экспрессии [rev. [21]].Однако у нас все еще мало знаний о молекулярных механизмах, участвующих в регуляции экспрессии гена SLC12A в клетках млекопитающих. Кроме того, для многих из этих исследований гетерологичной экспрессии множественные варианты сплайсинга KCCs даже не рассматриваются. Этот недостаток информации необходимо устранить, чтобы полностью понять индивидуальный вклад каждой изоформы в общий функциональный пул KCC. Все согласны с тем, что каждая изоформа экструдирует ионы K + и CI «как часть общего механизма, ответственного за регулирование объема клетки [5].Интересно, что несколько отчетов об использовании генетически модифицированных мышей с направленным разрушением определенных изоформ KCC привели к некоторым неожиданным фенотипам. Недавний обзор Drs. Gagnon и Delpire очень подробно описали результат целенаправленного разрушения как отдельных, так и множественных изоформ KCC [22]. В совокупности целевой нокаут конкретных изоформ KCC продемонстрировал две центральные темы: 1] существует некоторая функциональная реципрокность среди изоформ, т.е. понижающая регуляция одной изоформы может быть частично или полностью компенсирована повышающей регуляцией другой изоформы; и 2]

DOI: 10.1159/000356621

и издательство «Биохимия»: декабрь 8.2013 г.

Ганьон / Ди Фульвио: молекулярный анализ котранспортеров K Cl

Таблица 1. Варианты КСС. Показаны гены SL-C12A4, SLC12A5, SLC12A6 и SLC12A7, определенные уникальными идентификационными номерами генов (указаны в скобках), их продукты названы наиболее часто используемыми аббревиатурами (например, KCC1, KCC2, KCC3 и KCC4), за которыми следуют суффиксы, обозначающие сплайсинг. варианты.Также показаны номера доступа для каждой искусственно созданной эталонной мРНК или белковой последовательности (база данных RefSeq). Также указываются номера доступа, размещенные в базе данных GenBank, и источники тканей / клеток, из которых были получены эти последовательности. Примечание. Номера доступа RefSeq определяются уникальным форматом префикса, состоящим из двух символов, подчеркивания (например, NMj NP_, XM_ или XP_) и 6–9 цифр. Номера доступа GenBank чаще всего определяются с помощью буквенно-цифрового кода, представленного двумя заглавными буквами, за которыми следуют 6 цифр (например,g., BC021193 или AF116242). В отличие от RefSeq, база данных GenBank аннотирует экспериментально полученные последовательности.

] {urn jh ■ ir Mil ‘Spliced ​​Reference Reference Supput-llng SmirrtOf

Варианты мРНК Белки полноразмерная кДНК деины

LD \ A клоны

ÜLC12A4 (6560) KCCla NM.005072 NP.005063 BC021193 ретинобластома

KCC I h NM 001145%: NP 001139433 AKZ93906 мозжечок

KCC le NM.OO1139434 AK293956 мозжечок

KCC Id NM_001145963 NP_00113943S AK302790 Яичко

AK316415 Яичко

KCCle NM_001145964 NP „00]] 39436

KCC Если AK299042 teriUDCarcinonia

KCC Is APO47338 erythro leu kemla

KCC 111 AP054506 erythroleukemla

KCC1I AF054505 эритролейкемла

SLC12AS (5746BJ KCCZa NM.001134771 НП.001128243

KCC2b NM.020708 NP.065759 BC132668 объединенные ткани

BC132670 объединенные ткани

AK289758 мозг

AB033002 мозг

AP20B159 мозг

KCC2h-s 1 AK294059 мозжечок

KCC2b-s2 AK295096 мозг

KCC2b-s3 AK098371 мозг

SLC12A6 (9990) KCC 3 a NM_ 133647 NP_S98408 AFI05366

API16242 плацента

KCC3b NM.OO 10 42495 NP_001035960 APS31260

BC070107 семенник

KCC3e (a-s3) NM.001042496 NP.001035961 DQ138323

KCC3f (a-x2M) NM.0010 42497 NP, 0010359 62 AF531258

SLC12A7 (10723) KCC4a NMJ> 06598 NP..0 06589 AFI05365 почка

BC098390 Яичко

Нейробластома BC007760 без названия

BCD18982 нейробластома

Неназванный AK302S56 семенник

существует возможность, что эти переносчики могут участвовать в клеточных функциях, не связанных с их способностями к переносу ионов, как недавно было описано для некоторых изоформ KCC [23-26].

SLC12A4 (KCC1)

Молекулярные аспекты

Анализ in silico, связанный с комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислотой / тегами экспрессируемой последовательности (выравнивание кДНК / EST), выявляет присутствие 13 предполагаемых промоторов, 9 неперекрывающихся альтернативных последних экзонов и 6 проверенных альтернативных сайтов полиаденилирования в человеческом KCC1 ( hKCCl], то есть SLC12A4. Очевидно, что ген SLC12A4 может управлять транскрипцией нескольких различных мРНК (рис.1A]. Интересно, что некоторые из кДНК hKCCl, опубликованные в GenBank, короче, неполны или предположительно кодируют белки, которые либо не связаны с KCC1, либо не обладают способностью к переносу ионов. Хотя функциональное влияние этих более мелких транскриптов неизвестно, текущие данные свидетельствуют о том, что ген SLC12A4 человека (указанные мРНК в базе данных RefSeq, см. Таблицу 1) обладает способностью продуцировать по крайней мере пять белков котранспорта K-Cl путем альтернативного сплайсинга первых четырех экзонов. (Рис. 1A]. Соответственно, на основании нуклеотидных различий нескольких кДНК KCC1 RefSeq аннотировал пять нуклеотидных последовательностей hKCCl: NM_005072 (hKCCla), NM_001145961 (hKCClb), NM_001145962 (hKCClc], NM_001145963) (hKCClc], NM_001145963) (hKCClc], NM_001145963 .Важно отметить

DOI: 10.1159 / 000356621

и издательство Biochemistry pub

Ганьон / Ди Фульвио: молекулярный анализ котранспортеров K-CI

А SLC12A4 (hKCC1)

D i El DO □□ Ql 13 IZEZDQSSSB I III a

В SLC12A5 (hKCC2)

я лаоайский ему lEnsiEitaEaae be e

\ -. — «26

C SLC12A6 (hKCC3)

J 4 | nflHIIBHIIIIII II IB E B IE El a

D Si-C i 24 7 (hKCC4)

DBBQ BQDDO ¡El 13EE EOEQDB d El

Рис.1. Экзонная организация генов SLC12A4-7 и их альтернативный сплайсинг. Показаны немасштабные диаграммы экзонов, входящих в состав генов (A] SLC12A4 (hKCCl], (B) SLC12A5 (hKCC2], (C) SLC12A6 (hKCC3] и (D) SLC12A7 (hKCC4)). Эти экзоны обозначены как прямоугольники, соединенные линиями, представляющими альтернативное соединение, наблюдаемое в полноразмерных кДНК, размещенных в GenBank, которые являются поддерживающими клонами мРНК RefSeq (см. Таблицу 1). Кодирующие (черные прямоугольники) и некодирующие (серые прямоугольники) экзоны нумеруются постепенно по мере их появляются в генах от 5 ‘до 3’.Некоторые гены могут иметь экзоны как с кодирующими, так и с некодирующими способностями один раз в транскриптах, и, таким образом, эти экзоны обозначены комбинированными серыми и черными прямоугольниками.

, что больше KCC1 RefSeqs могут быть на пути к полному отражению транскриптома hKCCl. Пока что RefSeqs, отражающие различия в 3′-концах кДНК hKCCl, еще не созданы, несмотря на то, что полноразмерные кДНК hKCCl с различным сплайсингом с участием последнего экзона действительно существуют, то есть AF054505 и AF054506 [27] [27] [ см. Таблицу 1].Интересно отметить, что несколько потенциальных кодонов инициации присутствуют в эталонных мРНК, предполагая возможность того, что может действовать более одной открытой рамки считывания (ORF). Кроме того, выравнивание in silico последовательностей hKCCl, размещенное в GenBank, дает понять что хотя некоторые из этих мРНК hKCCl имеют идентичные или похожие ORF, существуют различия в их 5′-нетранслируемых областях (5′-UTRs), что указывает на потенциальные молекулярные сигнальные механизмы, которые могут влиять на молекулярную экспрессию, трансляцию и возможную функцию кодируемых белков котранспорта. .

Для целей этого обзора в этом разделе мы сосредоточимся на последовательностях hKCCl, полученных в результате альтернативного сплайсинга экзонов 1–4, исходя из предположения, что эти транскрипты будут продуцировать белки hKCCl, различающиеся в основном по своим N-концам (рис. 2). , область, которая содержит наибольшую вариабельность среди KCC и потенциальных регуляторных сайтов [5]. Также важно отметить, что делеция N-концевой области KCC1 приводила к функционально доминирующему негативному эффекту при совместной экспрессии с другими K- Котранспортеры Cl в ооцитах Xenopus laevis [28, 29].В экзоне 1 есть два неперекрывающихся первых кодона (A41UG и A142UG), где нумерация отражает положение нуклеотида относительно первого экзона. Первый кодон AUG кодирует инициирующий метионин (M1) hKCClc, тогда как второй Кодон AUG кодирует M1 в hKCCla и hKCClb. Экзон 2 содержит M1 белка hKCCle. Экзон 3 содержит M1 белка hKCCld. Интересно, что экзон 4 отсутствует

DOI: 10.1159 / 000356621

и издательство «Биохимия»: 8 декабря.2 ° 13

Ганьон / Ди Фульвио: молекулярный анализ котранспортеров K-CI

1 10 20

hKCCla MPHFp rfflv PVDG; > rrg 13 Y dn.LEGL s

hKCClb HPHF [rrflVPVDd ‘rrgd Y dm L EG i’. с

hKCClc mragHacrp- — —- Ba A

hKCCld haael, v cg- F V0LEGH | A

hKCCle

60 70

г [T] A G \ Z

IWAV D MG D

GERAKLD1 GE A ELD]

D GHGWHRE D- GHGN HRE

aaggwdg — ■ (

epla [s] c []] iiHGNHRElSS l [|] p —— 1hghhre | ss

hKCCla l s | ———— год

hKCClb l s i ——— год выпуска

hKCClc [| s | w c qw [t) g r g a a [] m | Z; Wf

hKCCld l s p ———— ilea rgid y y

hKCCle l s p ———— & ea | rg i d y_y

80 90 100

DRNL & —- LFElEELDIRPKVSSLLG

DRNLA L F ejee ldir p k v s s l lg

j lja □ meeldirpkvssllg

дркла —- LFELEELDIRPKVSSLLG

DRNL & —— L F ee eldirpkvssllg

• —Exon 6

Рис.2. Выравнивание N-концевых областей предсказанных вариантов сплайсинга KCC1. Выравнивание последовательности белков, выполняемое с использованием алгоритма MAFFT v7 Katoh et al. [83] предполагаемых N-концевых областей hKCCla, b, c, d и e. Процент сходства между остатками, рассчитанный с помощью матрицы Blosum90, показан четырьмя разными цветами. Зеленые остатки имеют 100% идентичность, светло-зеленые остатки имеют 80-99%, желтые остатки имеют 60-79%, а серые остатки указывают на идентичность менее 60%. Потенциальные сайты опосредованного киназой фосфорилирования согласно расчетам KinasePhos (_kinasephos.mbc.nctu.edu.tw) указаны в открытых полях.

только в hKCClc, тогда как экзоны 2 и 3 присутствуют в hKCCle и KCCld соответственно. Последовательность GTG GAG GTG GTG GAG ATG, соответствующая последним 18 нуклеотидам в экзоне 23, сплайсирована в hKCClb. Это событие сплайсинга предсказывает экспрессию белка котранспортера, укороченного на 6 аминокислот (VEVVEN) в предполагаемой C-концевой области цитоплазмы.Хотя SLC12A4 обычно считается геном домашнего хозяйства, экспрессирующимся в большинстве, если не во всех тканях (см. Рис.3], паттерн экспрессии или функциональное значение различных транскриптов hKCCl в различных тканях человека в настоящее время неизвестны.

Функциональные и физиологические аспекты

Очевидно, что высокая вариабельность транскриптов hKCCl не только отражает способность гена SLC12A4 продуцировать котранспортерные белки с различными функциональными или регуляторными свойствами, но также указывает на потенциальное значение различных hKCCls в регуляции объема клеток или [CI-] .. Это особенно привлекательно, когда мы рассматриваем KCC1 как ген «домашнего хозяйства», экспрессируемый во всех клетках. Интересно, что hKCCl, по-видимому, экспрессируется на низких уровнях по сравнению с другими KCC (рис. 3, закрашенные кружки), и отсутствие функционального KCC1 у грызунов (мыши KCC1K0) не приводит к явным фенотипическим аномалиям [30]. Отсутствие очевидных клинических проявлений. у этих мышей предполагают, что KCC1 может быть функционально избыточным геном, активность которого может быть заменена другими членами KCC или любым другим геном с аналогичными общими функциями.Кроме того, разные варианты KCC1 с разными регуляторными свойствами могут существовать у грызунов, но не у людей, или наоборот. Фактически, у мыши были описаны два варианта KCC1, которые, в свою очередь, не являются результатом событий сплайсинга, гомологичных тем, которые обнаруживаются у человека. Действительно, mKCCla (NM_001253804) и mKCClb (NM_009195) различаются между собой включением последних шести нуклеотидов (GGUGAG) первого экзона гена Slcl2a4 мыши. Это означает разницу в двух аминокислотах (глицин, глутаминовая кислота) в зрелом белке mKCCl.Придают ли эти две дополнительные аминокислоты различные функциональные свойства грызуну KCC1, в настоящее время неизвестно, но предполагает, что следует проявлять осторожность при интерпретации результатов с использованием различных моделей или видов.

SLC12A5 (KCC2)

Молекулярные аспекты

Ген KCC2 человека (hKCC2, SLC12A5, Gene ID 57468) кодирует полноразмерные транскрипты, которые, как предполагается, будут генерировать несколько KCC2 или более короткие транскрипты, управляемые SLC12A5

DOI: 10.1159/000356621

и издательство «Биохимия»: декабрь 8.2013 г.

Ганьон / Ди Фульвио: молекулярный анализ котранспортеров K-CI

Рис. 3. Характер экспрессии транскриптов hKCC в тканях и клетках человека. Уровни экспрессии транскрипта были получены из атласа генов человеческого транскриптома, опубликованного Su et al. [84] и размещены в общедоступной базе данных GEO Profiles (запись GDS596). Профиль экспрессии мРНК hKCCl (закрашенные кружки), hKCC2 (светлые кружки), hKCC3 (светлые квадраты) и hKCC4 (закрашенные квадраты) количественно оценивали с использованием следующих наборов зондов: 209400_at (hKCCl), 210040.при (hKCC2), 220740_s_at (hKCC3) и 218066_at (hKCC4). Результаты представлены в виде абсолютных уровней экспрессии мРНК в произвольных единицах. Необработанные данные доступны на сайте www.ncbi.nlm.nih. gov / sites / GDSbrowser? acc = GDS596.

Миндалевидное тело -m □ ■ o

Цветоножки мозжечка — • □ ■ O

Циркуляционная кора — * □ m O

Гипоталамус — * o ■ o

продолговатый мозг — • c ■ o

Затылочная доля — • □ ■ o

Обонятельная лампа Q ■

Теменная доля — «□ ■ o

Префронтальная кора — ■ □ ■ o

Pons — • ■ o

Височная доля •:: ■ 0

Таламус — «: ■ o

Ганглий тройничного нерва — □ ■

Весь мозг -9 □ ■ o

Caudale nucteus — • □ ■ 0

Мозжечок □ ■ o

Globus pallid js — • ■ o

Субталамическое ядро ​​- ■ o

Спинной мозг ■

Ресничный узел — o * □ ■

Верхний шейный ганглий — »o □ ■

Ганглии спинной крутки — 9

Мозг плода — ед.

Щитовидная железа плода -oo ■

Печень плода — * ■

Feial легкое <■

Дентрильные клетки -t_ ■

Клетки бронхиального эпителия ■

Поджелудочная железа 4 ■

Островки поджелудочной железы ■

Эндотелиальные клетки -t_ ■

CD71 + Ранние эриттироидные клетки -c ■

Бэйн манов -i (D ■

Надпочечник — * cn ■

Adrenat Cortex — • a ■

Адипоцит c: ■

Яичник — <* □ ■

Плацента — tfl ■

Матка -Cj ■

Корпус матки — _ ■

Простата 4 ■

яичка □ ■

Семенниковый семенной каналец — «o □ ■

семенник Зародышевые клетки — м □ ■

Промежуточное яичко — * □ ■

Ячейки Лейдлга — • 0 o ■

Сердце — ■

Атриовентрикулярный узел — •: □ ■

Приложение — * CQ ■

Лимфатический узел ■ *!} ■

Легкое — «O □ ■

Печень — a M □

Скелетная мышца -r ~ M

Гладкая мышца -oi • KCC1

Сердечные миоциты Язык — к ■ m O KCC2

Слюнная железа «! ■ □ KCC3

Гипофиз — CD Кожа «■ ■ ■ KCC4

Тимус — * □ ■

Щитовидная железа -d ■

Миндалины — * ок. ■

Трахея — «■

Почки — »aj ■

я 0 1 1 2 3 4 5

Абсолютная экспрессия мРНК hKCC (Alls X1000)

(AK098371, AK294059, AK295096), которые, как предполагается, кодируют белки с потенциальными функциональными свойствами, не связанными с переносом ионов.Ген SLC12A5 транскрибирует по крайней мере два функциональных варианта сплайсинга hKCC2, оба аннотированы как два контрольных транскрипта: NM_001134771 (hKCC2a) и NM_020708 (hKCC2b). Предполагается, что варианты KCC2a существуют на основе включения одного из двух взаимоисключающих первых экзонов, расположенных на расстоянии 7,2 т.п.н. друг от друга в наиболее дистальной 5′-области генов SIcl2a5 позвоночных, причем два человеческих EST демонстрируют прямое сплайсинг экзона la и экзона. 2 (DA102113 и DA328785], и полноразмерную кДНК из гиппокампа крысы E18 на эмбриональный день [EF641113 [31]].Включение экзона 1 (экзон 1a) или экзона 2 (экзон lb) в зрелый транскрипт hKCC2 зависит от выбора двух разных промоторов, расположенных в 5 ‘от каждого первого экзона, плюс объединенное событие сплайсинга в случае первого, но не в случае первого экзона. последний (рис. 4A). Включение экзона 1 в мРНК hKCC2 создает hKCC2a, транскрипт, который, как предполагается, кодирует котранспортерные белки с уникальными 40 N-концевыми аминокислотами [31]. Если вместо первого экзона, второй экзон SLC12A5 ген включается в мРНК hKCC2, образуется вариант hKCC2b, исходный вариант клонируется из нейронов [17].В дополнение к hKCC2a и hKCC2b, анализ in silico полноразмерных кДНК hKCC2b, размещенных в GenBank (т.е. AK294059, AK295096 и AK098371), предполагает, что пре-мРНК hKCC2b могут подвергаться дополнительным событиям сплайсинга. кДНК hKCC2 длины: AF208159 [32], BC132668, BC132670 [33] и AK289758. Анализ in silico также выявил три транскрипта hKCC2b: hKCC2b-sl (AK294059], созданный путем исключения экзонов 4-9, созданный hKCC2b-s2 (AK295096) путем исключения экзонов 3-20 и hKCC2b-s3 (AK098371]

DOI: 10.1159/000356621

и издательство Biochemistry pub

Ганьон / Ди Фульвио: молекулярный анализ котранспортеров K-CI

© 2013 С. КаргерАГ, Базель www.karger.com/cpb

hKCC2b

hKCC2aI

: AF2oet59 «<294059 AK295096 AK09 и 371 UA102113 DA3287B5

Рис. 4. Варианты транскриптов гена SLC12A5. (A) Изображены репрезентативные полноразмерные кДНК транскриптов hKC-C2a (номера доступа DA102113 и DA328785) и транскриптов hKCC2b (номера доступа AK289758, BC132668, BC132670 и AF208159), размещенных в базе данных GenBank.Есть также два дополнительных более коротких варианта транскрипта, продуцируемых геном SLC12A5 (номера доступа AK294059 и AK295096), (B) Выравнивание предсказанных белковых последовательностей, кодируемых кДНК AK294059 и BC132670 (hKCC2b), с использованием алгоритма MAFFT v7 [83]. остатки имеют 100% идентичность, светло-зеленые остатки имеют 80-99%, желтые остатки имеют 60-79%, а серые остатки указывают на идентичность менее 60%. (C) Выравнивание белковых последовательностей наиболее дистальных N-концевых остатков hKCC2a и hKCC2b, как предсказано полноразмерной кДНК AK289758 и EST DA102113. L QN I FCVUFHL

Крышка 1 * 0110100 IT0 110

AK294059 BfT—

BC132870 T®VVG iagihesfcmvficcsctmltaismsaiatngvvpaggsyymisrslgpefggav

№: oo]: c an! ■ (№

AK294059 П *

BC132670 GLCFYLGTTFACAMYILGTIEI LLAYLFflHAI FKftEDABGEAAAHLHNMRVYG TCVLTC

¿10 300 3 »..1 3 »100

AK294Q59 ………-……… iHi …….-………- M …….-. ……..-

BC132670 KATVVFVGVK YVNKFALVFBGBVI LS I LAI YAGVIKSAFDHNFHI CLLGHRTI.BRHG FD

OJKJn 0

■ IC ‘.C tTaa g 11 (1 HO 31 (1

AK294059 CS HI. ■ icSI

SC132670 FLA ударил Q ‘ft! Я

hKCC2a lSRH FBVTS LPPf HKCC2b Ii.-JNLBDCEDGDG

| pftRSPDPE5RRHi ‘.’MsM I HXtPGEDV I | ———— KMH ——

, созданный включением альтернативного стоп-кодона, расположенного в экзоне 8. В транскриптах hKCC2b может существовать дополнительная потенциальная вариабельность. Действительно, потенциальное использование альтернативного кодона AUG, расположенного в 18 п.н. от конца экзона b (экзон 2), отсутствие последних 65 п.н. экзона 4, экзона 5-8 и первых 112 п.н. экзона 9 в AK294059 приводит к в потенциальном белке из 855 аминокислот (~ 96 кДа) с топологией, состоящей из девяти трансмембранных доменов, внутриклеточного N-конца с 59 уникальными остатками и внеклеточного C-конца.За исключением тканей, в которых были клонированы эти кДНК, и нескольких примеров из ненейрональных клеток, где был обнаружен KCC2 [25, 34-37], характер экспрессии этих транскриптов неизвестен. Хотя активность KCC2 была тщательно охарактеризована в различных гетерологичных функциональных экспериментах, не всегда сообщалось о том, какой вариант (ы) KCC2b был экспрессирован и изучен.

Наконец, хотя полноразмерные клоны кДНК hKCC2a еще не доступны, важно иметь в виду, что, подобно KCC1 [см. Предыдущий раздел), варианты грызунов могут не обнаруживаться у людей и наоборот.

rom.lntnr ,, ™ V.Vm mDMic

регуляторное влияние на другие мРНК hKCC2

DOI: 10.1159 / 000356621

и издательство Biochemistry pub

Ганьон / Ди Фульвио: молекулярный анализ котранспортеров K-CI

Функциональные и физиологические аспекты

В отличие от повсеместного KCC1, продукт гена SLC12A5 [i.e., KCC2] долгое время считали нейрон-специфическим котранспортером, за заметным исключением ноцицептивных нейронов ганглия задних корешков, где экспрессия KCC2 очень низкая, если не отсутствует [38]. Нейрональный KCC2 считается прототипом экструдера CI, который делает возможным гиперполяризующий или ингибирующий эффект гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) в зрелых нейронах [39-41]. Несмотря на то, что KCC2 обильно экспрессируется в центральных нейронах [17] ], низкие уровни экспрессии KCC2 также были зарегистрированы в нескольких экстра-нейрональных тканях: клетках гладких мышц сосудов крысы [37], семенниках мыши [31], человеческих остеобластах [42], клетках эндометрия человека [25], эпителиальных клетках хрусталика человека. [34], кардиомиоциты курицы [35] и островки поджелудочной железы человека [36].Фактически, транскрипты KCC2 могут широко присутствовать, хотя и на очень низких уровнях по сравнению со зрелыми нейронами центральной нервной системы (ЦНС) (рис. 3). Функциональное влияние экспрессии KCC2 во вненейронных клетках в настоящее время неизвестно.

По функциональному сравнению с основными вариантами сплайсинга трех дополнительных KCC, т.е. KCC1, KCC3 и KCC4, грызуны KCC2a и KCC2b являются конститутивно активными котранспортерами в нормальных изотонических условиях, и эта активность может быть дополнительно стимулирована в гипотонических условиях [6, 31, 41, 43, 44].Таким образом, ожидается, что клетки, экспрессирующие KCC2, будут экспрессировать функциональную экструзию CI «и уменьшать регуляторный объем при набухании клеток. Однако взаимосвязь между KCC2-опосредованным [CI”], регуляцией и потенциальной способностью KCC2 регулировать объем клеток все еще неясна, в основном потому, что текущие знания о функции KCC2 получены только для экспериментов, изучающих роль KCC2b в вытеснении CI «из нейронов [40, 41]. Кроме того, нацеленная делеция [45] или нарушение [46] экзона 5 в гене SIcl2a5 мыши устраняет KCC2 экспрессия у мышей, приводящая к смерти при рождении из-за тяжелого двигательного дефицита.Интересно, что целенаправленное удаление экзона lb в гене SIcl2a5 мыши не устраняет полностью экспрессию mKCC2a [31], давая мышей, которые могут выжить по крайней мере в течение ~ 12 дней после рождения [47]. Хотя эти данные предполагают, что оба варианта mKCC2 имеют жизненно важное значение для развития мышей, они также предполагают, что естественно низкие уровни mKCC2a недостаточны для компенсации дефицита mKCC2b, и что последний может подвергаться дифференциальной регуляции экспрессии. Это согласуется с представлением о том, что в отличие от KCC2a, KCC2b регулируется в процессе развития [31], что повышает вероятность того, что KCC2a может не иметь такого значения, как KCC2b в [CI «], регуляции.Однако к этой последней концепции следует относиться с осторожностью. В самом деле, KCC2a и KCC2b могут образовывать гетеродимеры [48, 49], а KCC2b может регулировать пролиферацию клеток, дифференцировку нейронов, миграцию и глутаматергический / ГАМКергический синаптогенез независимо от своей транспортной активности [23-26].

Таким образом, имеется множество доказательств того, что KCC2b является конститутивно активным котранспортером, участвующим в экструзии CI в нейронах, и что эта активность делает возможными гиперполяризующие и ингибирующие действия GABA, наблюдаемые в зрелых центральных нейронах [39-41].Эта концепция особенно интересна, если рассматривать ее в контексте ненейрональных клеток, коэкспрессирующих KCC2 и рецептор ГАМК, связанный с каналом Cl, таких как клетки островка поджелудочной железы [36] или гладкие мышцы сосудов [37]. Функциональное влияние KCC2 на эти клетки еще предстоит определить.

SLC12A6 (KCC3)

Молекулярные аспекты

Три транскрипта гена SLC12A6 (7,5 т.п.н., 4,3 т.п.н. и 9,0 т.п.н.) были дифференциально обнаружены в человеческом мозге, плаценте, скелетных мышцах, сердце, печени, легких, почках и поджелудочной железе, а также в нескольких линиях клеток человеческого происхождения [20 ].Фактически, профили экспрессии тканей человека демонстрируют, что транскрипты KCC3 присутствуют на разных уровнях в широком спектре тканей человека (рис. 3). Анализ in silico транскриптов hKCC3, клонированных из различных источников и опубликованных в общедоступных базах данных последовательностей, показывает, что они являются результатом альтернативного выбора промоторов в гене SLC12A6, использования первых кодирующих экзонов и альтернативного сплайсинга полных или частичных экзонов (рис. 1C). Эти транскрипты hKCC3 идентифицированы в ReJSeq

DOI: 10.1159/000356621

и издательство Biochemistry pub

Ганьон / Ди Фульвио: молекулярный анализ котранспортеров K-CI

как: NM_133647 (hKCC3a], NM_005135 (hKCC3b], NM_001042494 (hKCC3c], NM_001042495 (hKCC3d], NM_001042496 (hKCC3e] и NM_001042497 (hKCC3e]) и NM_001042497 (hKCC3f], каждый из этих полных транскриптов определяется по ссылке кДНК hKCC3 [см. рис. 1C и таблицу 1]. Две кДНК hKCC3 определяют транспортер hKCC3a [AF105366 [19, 50] и AF116242 [20]], поскольку оба они, как предполагается, кодируют идентичный белок из 1150 аминокислот (~ 128 кДа).Интересно, что два других транскрипта, а именно BC033894 [33] и AK292550, которые также кодируют белки hKCC3a, различаются своими 5′- и 3′-UTR относительно AF105366 и AF116242. Эта особенность разных транскриптов, кодирующих один и тот же белок, может отражать потенциальные регуляторные свойства трансляции.

Второй вариант сплайсинга гена SLC12A6, hKCC3b, определяется четырьмя клонами полноразмерной кДНК человека, полученными из эндотелиальных клеток человека, мозжечка и матки: AF108831 [18], BC126241, BC126243 [33] и AK315283.Каждая из этих кДНК кодирует белок из 1099 аминокислот (~ 122 кДа). Третий вариант, hKCC3c, кодируется двумя идентичными кДНК, клонированными из человеческого мозга и семенников: AF531259 [первоначально названные KCC3a-sl, [50]] и AF477977 Обе кДНК hKCC3c продуцируют концептуальный белок из 1091 аминокислоты (~ 121 кДа). Четвертый вариант hKCC3, названный здесь hKCC3d, определяется двумя кДНК, полученными из человеческого мозга и семенников: AF531260 [первоначально названный KCC3a-s2 [50] ]] и BC070107 [33] соответственно.Предполагается, что эти кДНК кодируют белок-транспортер из 1091 аминокислоты (~ 121 кДа). Пятый и шестой варианты hKCC3 [т.е. hKCC3e и hKCC3f] определяются по одной кДНК hKCC3 каждая: DQ138323 и AF531258 [первоначально названные KCC3a- s3 и KCC3a-x2M, соответственно [50]]. Предполагается, что эти кДНК, представляющие hKCC3e и hKCC3f, кодируют белки из 1141 и 1135 аминокислот (~ 127 кДа) соответственно.

Анализ in silico этих шести кДНК hKCC3 выявляет ключевые различия на их 5′-концах в области, определяемой экзонами 1, 2, 3 и 4 (рис.1C]. Действительно, включение или исключение экзона 1 и экзона 2 в сочетании с альтернативным использованием трех разных сайтов сплайсинга в экзоне 3, который содержит три предполагаемых инициирующих кодона (AUG), определяет молекулярную структуру 5′-UTR и N- концевой области hKCC3a, hKCC3c, hKCC3d, hKCC3e и hKCC3f. Кроме того, анализ in silico выровненных кДНК hKCC3, определяющих эти варианты, показывает, что в транскриптах отсутствует экзон 4, который может находиться под управлением второго промотора, расположенного в интроне 3.Следовательно, hKCC3a, hKCC3c, hKCC3d, hKCC3e и hKCC3f являются результатом транскрипции с первого промотора гена SLC12A6, альтернативного сплайсинга экзона 1, 2 и 3 и исключения экзона 4. Выбор второго потенциального промотора создает hKCC3b. Помимо этих сложных событий сплайсинга, единственным другим различием между hKCC3a и hKCC3f является исключение экзона 5 в hKCC3f. Важно отметить, что репертуар транскриптов SLC12A6 может не ограничиваться вариантами, описанными выше.Действительно, ген SLC12A6 человека может управлять экспрессией идентичных белков hKCC3 с использованием различных транскриптов. Эти мРНК являются результатом альтернативного выбора коротких 5′-UTR экзонов, сайтов внутреннего сплайсинга или полиаденилирования (рис. 5. В целом, существование этих множественных транскриптов SLC12A6 позволяет предположить наличие множества различных белков hKCC3 [см. Рис. 6].

Функциональные и физиологические аспекты

Большая часть наших знаний о KCC3a человека была получена из исследований на клетках млекопитающих и гетерологичной сверхэкспрессии в ооцитах амфибий [rev. [5]].Однако множество различных транскриптов KCC3 могут определять пул функциональных белков hKCC3. Фактически, альтернативный сплайсинг одной мРНК может привести к появлению нескольких белков KCC3, ответственных за наблюдаемую функциональную активность (рис. 6). Независимо от потенциальной множественности продуктов SLC12A6, в целом hKCC3 играет ключевую роль в гомеостазе калия и хлоридов, регуляции объема клеток. и электрические ответы на ГАМК и глицин [40] Фактически, hKCC2 и hKCC3, вместе с NKCCs, считаются частью регуляторного аппарата, участвующего в регуляции нейронов [CI »] [40].Действительно, отсутствие KCC3 приводит к увеличению [CI ”] в нейронах [51] и гладкомышечных клетках сосудов [52]. Однако, в отличие от hKCC2, hKCC3 оказывает явное влияние на регуляцию объема клеток, когда чрезмерно экспрессируется в клеточных линиях или ооцитов, несмотря на то, что только hKCC2 является конститутивно активным в изотонических физиологических условиях [20, 31, 35].

DOI: 10. / VWW.WVVVV; BC051709

Рис. 5. Варианты транскрипта гена SLC12A6. Представлены множественные полноразмерные кДНК человека, являющиеся продуктами транскрипционной активности гена SLC12A6 человека. Экзоны обозначены прямоугольниками, а их потенциальное сращивание — линиями. Серые прямоугольники представляют 5′- или 3′-UTR, а цветные прямоугольники указывают идентичные последовательности. Показано кодирование RefSeqs для hKCC3a, b, c, d, e и f (NM_133647, NM_005135, NM_001042494, NM_001042495, NM_001042496 и NM_001042497, соответственно].Также показаны потенциальные варианты hKCC3a (BC033894 и AK292550), включающие альтернативный сплайсинг исходных некодирующих экзонов и более коротких 3′-UTR, а также четыре варианта, характеризующиеся выбором внутренних сайтов сплайсинга на своих 3′-концах и потенциально ответственными за вариабельность в C-концы hKCC3 (AK128133, BC051744, BX648195 и BC051709). Этим последним вариантам в настоящее время не присвоены номера доступа RefSeq, поэтому мы не присвоили отдельные буквы этим потенциальным вариантам KCC3.

Следовательно, в случае любого типа клеток, в котором коэкспрессируются как KCC2, так и KCC3, вполне вероятно, что эти котранспортеры играют скоординированную, но отличительную роль в регуляции клеточного объема и [CI »] гомеостазе в физиологических условиях. , недавние данные свидетельствуют о том, что KCC3 и KCC2 образуют олигомеры, ассоциацию с доминантно-отрицательными характеристиками, что повышает вероятность того, что эти KCC могут обладать взаимными ко-регуляторными свойствами [53].

Большинство вариантов hKCC3 проявляют гипотонически активируемую котранспортную активность K-Cl при сверхэкспрессии в ооцитах Xenopus laevis [50].Однако, несмотря на то, что как hKCC3a, так и hKCC3b проявляют чувствительную к фуросемиду котранспортную активность K-Cl при чрезмерной экспрессии в линиях клеток человека, только hKCC3a функционально отвечает на гипотонический вызов [18, 20, 54]. Это интригует в том смысле, что оба варианта имеют идентичные С-концевые области, содержащие два ключевых остатка треонина (Thr «1 и Thr1048], непосредственно участвующие в функции котранспорта, активируемой набуханием [55]. Таким образом, неясно, существует ли это функциональное различие между Варианты hKCC3 связаны с уникальными аминокислотными последовательностями на их N-концах, с различным поведением KCC3 человека в клетках разных видов или даже с наличием специфичных для клетки регуляторных ограничений.В любом случае нельзя исключать возможность того, что некоторые варианты hKCC3 могут иметь избыточную транспортную функцию или еще не обнаруженные функции.

Очевидная функциональная сложность hKCC3s in vitro затемняется тем фактом, что не существует специфических фармакологических инструментов, которые можно было бы использовать для индивидуального анализа KCC3s на функциональном уровне. Кроме того, мало что известно о характере экспрессии различных мРНК KCC3 in vivo в тканях и клетках человека [56].Фактически, большая часть наших

DOI: 10.1159 / 000356621

и издательство Biochemistry pub

Ганьон / Ди Фульвио: молекулярный анализ котранспортеров K-CI

© 2013 С. КаргерАГ, Базель www.karger.com/cpb

A i it * i00 30C 400 тоже 600700 BOO 900 J.000 1,100 1,200 1,

Q6NSI7 HUUS1J NPjOSliS EAW92297 SAG37S91 AF1M831 1 AA и B62T6 AA126244 MI26242 MAvre HUMW AAH701Q7 Q7 и 67 HlftWN NP 001035660

NPjjotrewM

AAQ10027 AAQ10K8 EAW92295 EAW922% ABA02873 NPJ01035961 Q2VIOO HUNWN AAM96215 AF105366 1 EAW923S0 AF116242 1 BAF852J9 EAW92302 Q7HGS HUMttl NP D01035962 984 дюйма

Q5HYC7 ЧЕЛОВЕКА

Cil4№f2 EAW92299 EAW92298 Q3ZCQ6 ЧЕЛОВЕК AAH51744 AF477977 1 CAB559 «BAG54635

hKCC3a HHPPETTTKKASVRFKVTPTKJDDIPGl.SDTSPDI.SSFlSSSRVRFSSAESVPETSRSeS’H tiKCOf * KPS | ®TTKMA37RFMVTPTKIDDIPGLSI> TBF0L38R33SBVRFSSRESVPETSRSEP | hKCCie MASVRFMVTPTKIDDIPGL5DTSPDLS3RSSSRVRFSSRESV PETSR5EPJ

ч «C3t> ri P H FT VT K V E DP E E GAAASIS QE RSLAD IK ARI_QD3DE P

чKCC3>

hM0C3c

rfPTRPKVSS LLHRHANYTNLTOGAKE HEEAE HI MDT ft P KV SSLLHR NAii 7 T i (LT G GA KEKEEAK NI MOTRPKVSS LLNRKAH ¥ TNljTGGAKE} 1EEA £ N! HDTRPKVSS1LHLHRKENGA HI MDT HI MDT HI MDT NI KVSS1LHLHRKEN GREEN HI MDT NI HI MDT NI MOTRPKVSS LLNRKAH ¥ TNljTGGAKE} 1EEA £ N! KVSS1L h’RHAN TT N LT QGAKE H EE A EH I HDTPPKVSSLLilRHAIiVTNLTCGAFETIEEAENr

EGKKKPTKT T EGK KKP’Ffc 7

тегкккптктI

EGKKKPT>: 7 TEGKKJtPTKTl TEGKKKPTKTj TEGKKKRTFT

AFI0536S AF531258 UQ136323 «= 108831 5C051744

LTAIUMSA MLTA

AM 77977 AK126133

B70 eeo 890 N00 910 920 930 940 950 960

Af105366 — G7VRVTT.мам J

BC0S1744 — STVfcVTT AAHLALV |

BX646195

951 подходит 9SD M0 1DOO 1010. 1020 1030 1D40 1058

AFI05356: .TF:, V asOMLRHNRL: iKTEROREAaiVKDRNSMLRI -TS JGSDED? E

BC05I744; ■ 1 ‘1

1057 1070106 ¡0 i09D 1100, 1110 1120 1130 1140 1151

Рис. 6. Потенциально исключительное разнообразие белков SLC12A6.(A) Грубое выравнивание сорока одной белковой последовательности, предсказанной на основе транскриптов человеческого SLC12A6 и размещенной в базе данных GenBank под указанными номерами доступа. Выравнивание было выполнено с использованием MAFFT v7 [83] и вручную организовано в кластеры, чтобы выделить изменчивость в N- и C -концы белков SLC12A6. Общая степень идентичности, рассчитанная для всех последовательностей, нанесена на график поверх выравнивания. Зеленый и красный цвета представляют 100% и 0% идентичности среди последовательностей, соответственно. Различные степени идентичности представлены в последовательностях разными оттенки серого.(B) Выравнивание наиболее дистальной области N-конца hKCC3a (AF105366], hKCC3b (AF108831], hKCC3c (AF477977], hKCC3e (DQ138323], hKCC3f (AF531258) и двух последовательностей SLC12A6 и в настоящее время номенклатурных и ожидающих ссылки AK128133]. Следовательно, они обозначены как KCC3, за которыми следует вопросительный знак и их регистрационные номера в GenBank. (C) Показано выравнивание наиболее дистальной C-концевой области двух безымянных и не упомянутых последовательностей SLC12A6 с C-концом. ofhKCC3a (AF105366],

DOI: 10.1159/000356621

и издательство Biochemistry pub

Ганьон / Ди Фульвио: молекулярный анализ котранспортеров K-Cl

знаний, связанных с паттерном экспрессии KCC3 на уровне белка или транскрипта, получены в результате экспериментов, проведенных на тканях грызунов, особенно в центральной и периферической нервной системе [38, 50, 51, 57-61]. Тем не менее актуальность экспрессии гена SLC12A6 в центральной и периферической нервной системе очевидна, поскольку мутации в этом гене у людей связаны с синдромом Андермана (болезнь Шарлевуа), сенсомоторной полинейропатией с агенезом мозолистого тела или без него [62-65 ].У мышей мутации в гене Slcl2a6 приводят к фенотипу, напоминающему состояние человека [51, 66, 67]. За пределами нервной системы несколько линий доказательств предполагают, что KCC3 может оказывать физиологическое влияние на гомеостаз сосудов. По крайней мере, два варианта KCC3 экспрессируются в гладкомышечных клетках сосудов крыс или человека [18, 68, 69], где их транспортная функция, по-видимому, регулируется оксидом азота и вазодилататорами [rev. [5]]. Более того, мыши, лишенные функционального KCC3, обнаруживают повышенное артериальное кровяное давление, указывая тем самым, что активность KCC3 связана с расширением сосудов [51, 70].Однако недавние наблюдения подтверждают, что гипертензивный фенотип, наблюдаемый у мышей с нокаутом KCC3, является следствием повышенного симпатического тонуса, независимо от функции KCC3 [52]. Хотя транскрипты KCC3 относительно многочисленны в различных тканях человека или мыши, таких как сердце, скелетные мышцы, легкие, поджелудочная железа или почки [19, 51], функциональное влияние этого переносчика на физиологию большинства этих органов все еще остается неясным.

SLC12A7 (KCC4)

Молекулярные аспекты

Четвертый член Na + -независимой CCC, KCC4, продуцируется геном SLC12A7, расположенным в пятой хромосоме человека (5pl5) [19].Ген SLC12A7 занимает ~ 61 т.п.н. обратной геномной последовательности и содержит не менее 25 кодирующих экзонов. Интересно, что экзон 23 длиной всего 15 п.н. отсутствует в полноразмерных транскриптах, полученных из этого гена, как опубликовано в GenBank и аннотировано в базе данных RefSeq (рис. ID). Важно отметить, что RefSeq также аннотирует транскрипт SLC12A7, который включает экзон 23 (XM_005248231]. Хотя эта мРНК KCC4 подтверждается выравниванием RNAseq, ее существование в виде полного транскрипта требует подтверждения. Как показал Нозерн-блот-анализ, транскрипты гена SLC12A7, по-видимому, широко распространены в тканях человека [19, 71 ].Фактически, транскрипты KCC4 высоко экспрессируются по сравнению со средними генами почти во всех тканях человека, о чем судят по частичным или полноразмерным последовательностям кДНК / EST, указанным в GenBank, базе данных EST [dbEST] и профили экспрессии тканей человека (рис. 3). ].

Среди последовательностей кДНК hKCC4, размещенных в GenBank, есть четыре полноразмерных транскрипта SLC12A7, аннотированных номерами доступа AF105365 [частичный клон, первоначально названный hKCC3 [19]], BC007760, BC018982 и BC098390 [33].Первая и последняя кДНК hKCC4 (AF105365 и BC098390) были получены из разных источников, но идентичны по кодирующим последовательностям. Эти характеристики в сочетании с существованием более 90 EST, происходящих из гена SLC12A7, рассматриваются как свидетельство создания Контрольная последовательность мРНК hKCC4 [RefSeq], определенная номером доступа NM_006598 и названная здесь hKCC4a (Таблица 1).

Два дополнительных полноразмерных клона hKCC4 (BC007760 и BC018982) были получены из линий клеток мозга или нейробластомы человека [33].Анализ in silico этих клонов при сравнении с последовательностями кДНК hKCC4a показывает, что они идентичны по своей кодирующей последовательности, но не имеют экзонов 7-24 и первых 119 пар оснований последнего экзона 25 (рис. ID). Следовательно, эти транскрипты могут не кодируют котранспортеры K-Cl, как мы их знаем, а скорее очень разные белки.Дополнительный, вероятно неполный продукт транскрипции гена SLC12A7 был получен из семенников и зарегистрирован в GenBank под номером доступа AK302856. Подобно BC007760 и BC018982, кДНК AK302856 соединяет экзонные последовательности, соответствующие первым 99 п.н. экзона 6 и последним 73 п.н. экзона 19, продуцируя транскрипт, который вряд ли может кодировать полный котранспортер K-Cl.В настоящее время неизвестно, широко ли экспрессируются эти транскрипты и действительно ли они продуцируют функциональные белки.

DOI: 10.1159 / 000356621

и издательство Biochemistry pub

Ганьон / Ди Фульвио: молекулярный анализ котранспортеров K-Cl

Функциональные и физиологические аспекты

Предполагается, что на уровне белка транскрипты hKCC4a кодируют белок из 1083 остатков и прогнозируемой молекулярной массы ~ 120 кДа.Однако в клетках или тканях человеческого происхождения hKCC4 обнаруживается в виде полос с более высокой молекулярной массой, возможно, из-за N-гликозилированной природы переносчика [72], как это было подтверждено для ортолога мыши при сверхэкспрессии в клетке человека. линии [73]. Подобно другим hKCCs, аминокислотная последовательность hKCC4, как предполагается, принимает конформацию, состоящую из 12 трансмембранных доменов, фланкированных двумя большими внутриклеточными N- и C-концами. Именно в этих внутриклеточных доменах находятся специфические остатки серина или треонина [i.е., S50, S62, T926 и T980], как предполагается, модулируют функцию совместного транспорта при дефосфорилировании [55]. Кроме того, предсказанная внеклеточная петля, соединяющая пятый и шестой трансмембранные домены hKCC4, содержит четыре предполагаемых сайта N-гликозилирования, то есть N312, N331, N344 и N360, которые также обнаруживаются в KCC4 мыши и крысы, а также в hKCCl, hKCC2 и hKCC3 (за исключением N344, который отсутствует в hKCCl или hKCC2). Судя по исследованиям сверхэкспрессии с использованием мышиного KCC4 в качестве модели, замена N312, N331, N344 и N360 на Q делает mKCC4 полностью дегликозилированным, что позволяет предположить что эти остатки могут подвергаться N-гликозилированию in vivo [73].В частности, эндогенный mKCC4 также обнаруживается в виде белковой полосы ~ 145 кДа в некоторых тканях центральной нервной системы мышей [74]. Однако в других тканях мышей, включая сердце, почки, печень и легкие, где транскрипты KCC4 наиболее выражены [19], эндогенный mKCC4 обнаруживается в виде белковой полосы ~ 120 кДа [75], что повышает вероятность того, что N-гликозилирование mKCC4 может иметь отношение к уровням экспрессии, типу клеток или даже к различным антителам, используемым для обнаружения переносчика в экспериментах по иммуноблоттингу с электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE).

Функциональные, фармакологические, регуляторные и кинетические свойства mKCC4 были тщательно установлены Mount et al. [19] и Mercado et al. [76] с использованием гетерологичной экспрессии в ооцитах Xenopus laevis [обзор в [4]]. Интересно, что сверхэкспрессия mKCC4 приводила к устойчивой котранспортной активности K-Cl только в гипотонических условиях. Хотя эта характеристика характерна для KCC1 и KCC3, степень активации KCC4 по сравнению с KCC1 была в десять раз выше [76].Интересно, что KCC4 ингибировался в разной степени по сравнению с другими KCC различными диуретиками, такими как фуросемид, буметанид, трихлорметиазид, бутилиндазон или DIDS (4,4-диизотиоцианатостильбен-2,2′-дисульфоновая кислота) [19, 76]

Несмотря на широко распространенную тканевую экспрессию KCC4, целевой глобальный нокаут KCC4 у мышей приводит к двум уникальным неизбыточным дефектам: канальцевому ацидозу (почки) и глухоте (внутреннее ухо) [75]. Было показано, что изменения pH стимулируют K- Котранспортная активность Cl в ооцитах лягушек, сверхэкспрессирующих кРНК KCC4 [77].Вместе с базолатеральной экспрессией KCC4 в α-интеркалированных клетках нефрона почек [75], активность mKCC4 в сочетании с другими переносчиками может влиять на обычно высокую способность обмена C1 «/ HC03» у α-интеркалированных клеток, тем самым способствуя наблюдаемый тубулярный ацидотический фенотип мышей, лишенных KCC4 [75]. Глухота из-за дегенерации волосковых клеток, вероятно, является результатом целенаправленного нокдауна KCC4 в поддерживающих клетках внешних и внутренних волосковых клеток, где он, вероятно, участвует в рециклинге K + [75].

Интересно, что mKCC4 также был обнаружен обильно экспрессирующимся в апикальных, а не базолатеральных мембранах некоторых эпителиев, особенно париетальных и хориоидальных клеток желудка, где котранспортер, как предполагается, играет роль в базальной секреции CI и K + гомеостазе спинномозговой жидкости, соответственно. [74, 78]. Однако о желудочных или центральных фенотипах не сообщалось у мышей, лишенных KCC4 [75], что позволяет предположить, что активность KCC4 в этих клетках может быть компенсирована присутствием других транспортеров.В этом отношении, хотя человеческий KCC4 был обнаружен в эритроцитах человека и мыши [54], общая котранспортная активность K-Cl минимальна в эритроцитах мышей, лишенных KCC1 и KCC3 [30]. Однако интерпретация этих результатов требует осторожности, поскольку последние авторы не нашли доказательств экспрессии белка KCC4 в этих клетках [30].

Широкое распространение KCC4 в клетках мышей и людей интригует, особенно в сочетании с тем фактом, что KCC4 стимулируется факторами роста, такими как инсулиноподобный рост

DOI: 10.1159/000356621

и издательство Biochemistry pub

Ганьон / Ди Фульвио: молекулярный анализ котранспортеров K Cl

Фактор

типа I (IGF-I) или фактор роста эпидермиса (EGF) [72, 79], которые обычно чрезмерно экспрессируются в некоторых типах раковых тканей [80, 81]. Фактически, недавние данные предполагают, что высокий KCC4 Экспрессия в клетках рака яичников и шейки матки человека способствует инвазивности и метастатическому потенциалу [72], и, таким образом, избыточная экспрессия этого переносчика при этих типах рака может быть связана с худшими клиническими исходами, наблюдаемыми у пациентов, страдающих этими состояниями [см. обзор в [22]].Другое интересное открытие состоит в том, что довольно часто KCC3 обнаруживается в тканях, экспрессирующих KCC4 [see Fig. 3]. Учитывая, что KCC1, KCC2, KCC3 и KCC4, как было обнаружено, образуют как гомо-, так и гетеродимеры [28, 29, 48, 49, 53, 82], возможно, что функциональная коэкспрессия этих транспортеров может быть нарушена. ко взаимному регулированию.

Заключение

Хотя существует только четыре гена, кодирующих NaMn-зависимые котранспортеры K-Cl у млекопитающих, количество альтернативных вариантов мРНК, обусловленных сплайсингом, и возможность некоторых из них направлять трансляцию белка с альтернативных сайтов инициации, повышает возможность множественных изоформ белков и множественные функциональные результаты.Например, человеческий KCC1, который был тщательно охарактеризован почти во всех тканях, теперь может фактически рассматриваться как представленный по крайней мере пятью различными белками. В другом примере наш анализ указывает на существование множества вариантов hKCC2 с различными функциональными свойствами, паттернами экспрессии и регуляцией. Фактически, этот долгое время считающийся специфичным для нейронов котранспортер был обнаружен в ненейрональных клетках с физиологической ролью, независимой от ионных транспортных возможностей белка.Имея более пятнадцати клонированных мРНК и по крайней мере шесть потенциально различных белков, hKCC3, по-видимому, представлен самым разнообразным набором вариантов транскриптов. Наш анализ in silico выявил несколько вариантов hKCCl, hKCC2 и hKCC3, которые различаются по своим N- или C-концам. Предполагается, что эти регионы играют важную прямую или косвенную регуляторную роль не только в функции их соответствующих переносчиков, но также в их способности регулировать судьбу друг друга посредством гетеродимеризации.В отличие от hKCCl, hKCC2 и hKCC3, был клонирован и охарактеризован единственный вариант hKCC4. Хотя этот факт не исключает открытия новых вариантов KCC4 в будущем, было бы интересно генетически пересмотреть функциональные исследования, проведенные за последние 30 лет в различных тканях, чтобы определить, может ли то, что когда-то считалось котранспортом K-Cl через одну изоформу, [например, активность KCC1] может фактически представлять функциональную комбинацию множества вариантов и / или альтернативно сплайсированных изоформ.

Конфликт интересов

Авторы не заявляют о конфликте интересов, финансовом или ином.

Благодарности

Мы благодарны Медицинской школе Буншофт государственного университета Райта за поддержку MDiF в рамках программы Seed Grant Program и гранту исследовательской группы Saskatchewan Health Research Group за поддержку KBG.

Список литературы

Ди Фульвио М., Альварес-Лифманс Ф. Дж .: Гены NKCC и NCC: взгляд in silico.; inAlvarez-Leefmans FJ, Delpire E (eds): Физиология и патология переносчиков хлоридов и каналов в нервной системе: от молекул до болезней. Лондон, Academic Press, Incorporated, 2009, стр. 169-208.

DOI: 10.1159 / 000356621

и издательство Biochemistry pub

Ганьон / Ди Фульвио: молекулярный анализ котранспортеров K-CI

2 Daigle ND, Carpentier GA, Frenette-Cotton R, Simard MG, Lefoll MH, Noel M, Caron L, Noel J, Isenring P: Молекулярная характеристика человеческого котранспортера катион-Cl- (SLC12A8A, CCC9A), который способствует продвижению полиамина и транспорт аминокислот.J. Cell Physiol 2009; 220: 680-689.

3 Caron L, Rousseau F, Gagnon E, Isenring P: Клонирование и функциональная характеристика белка, взаимодействующего с катион-Cl-котранспортером. J Biol Chem 2000; 275: 32027-32036.

4 Alvarez-Leefmans F: Регулирование внутриклеточного хлорида; в Справочнике по физиологии клетки: Основы биофизики мембраны; в Амстердаме; Бостон, Elsevier / AP, 2012, стр. 221-259.

5 Adragna NC, Di Fulvio M, Lauf PK: Регулирование котранспорта K-Cl: от функции к генам.J Membr Biol 2004; 201: 109-137.

6 Payne JA: Функциональная характеристика нейрон-специфичного котранспортера K-Cl: значение для регуляции [K +] o. Am J Physiol 1997; 273: C1516-1525.

7 Жан-Ксавье С., Пфлигер Дж. Ф., Лябеф С., Вине Л.: Тормозящие постсинаптические потенциалы в мотонейронах поясницы остаются деполяризующимися после неонатальной перерезки спинного мозга у крысы. Журнал Neurophysiol 2006; 96: 2274-2281.

8 Рейд К.Х., Го С.З., Айер В.Г.: Агенты, которые блокируют котранспорт хлорида калия, предотвращают спровоцированные звуком судороги у склонных к постишемическим аудиогенным припадкам крыс.Brain Res 2000; 864: 134-137.

9 Jessen F, Sjoholm C, Hoffmann EK: Идентификация анионообменного белка клеток Эрлиха: кинетический анализ ингибирующих эффектов 4,4′-диизотиоциано-2,2′-стильбен-дисульфоновой кислоты (DIDS) и маркировка мембранные белки с 3H-DIDS. J. Membr Biol 1986; 92: 195-205.

10 Lane M, Baltz JM, Bavister BD: Обмен бикарбоната / хлорида регулирует внутриклеточный pH эмбрионов, но не ооцитов хомяка.Биол Репрод 1999; 61: 452-457.

11 Matulef K, Howery AE, Tan L, Kobertz WR, Du Bois J, Maduke M: открытие мощных ингибиторов хлоридных каналов CLC. ACS Chem Biol 2008; 3: 419-428.

12 Delpire E, Lauf PK: Кинетика DIDS ингибирования активированного набуханием котранспорта K-Cl в эритроцитах барана с низким содержанием K. J. Membr Biol 1992; 126: 89-96.

13 Fujii T, Ohira Y, Itomi Y, Takahashi Y, Asano S, Morii M, Takeguchi N, Sakai H: Ингибирование АТФаз P-типа [(дигидроинденил) окси] уксусной кислотой (DIOA), K + -CI- ингибитор котранспортера.Eur J Pharmacol 2007; 560: 123-126.

14 Delpire E, Days E, Lewis LM, Mi D, Kim K, Lindsley CW, Weaver CD: Скрининг малых молекул выявляет ингибиторы нейронального котранспортера K-Cl KCC2. Proc Natl Acad Sci U S A2009; 106: 5383-5388.

15 Delpire E, Baranczak A, Waterson AG, Kim K, Kett N, Morrison RD, Daniels JS, Weaver CD, Lindsley CW: Дальнейшая оптимизация котранспортера K-Cl антагониста KCC2 ML077: разработка высокоселективного и более мощного зонда invitro .Bioorg Med Chem Lett 2012; 22: 4532-4535.

16 Gillen CM, Brill S, Payne JA, Forbush B, 3rd: Молекулярное клонирование и функциональная экспрессия котранспортера K-Cl от кролика, крысы и человека. Новый представитель семейства катионно-хлоридных котранспортеров. J Biol Chem 1996; 271: 16237-16244.

17 Пейн Дж. А., Стивенсон Т. Дж., Дональдсон Л. Ф.: Молекулярная характеристика предполагаемого котранспортера K-Cl в мозге крысы. Изоформа, специфичная для нейронов. J. Biol Chem. 1996; 271: 16245-16252.

18 Hiki K, DAndrea RJ, Furze J, Crawford J, Woollatt E, Sutherland GR, Vadas MA, Gamble JR: Клонирование, характеристика и хромосомное расположение нового человеческого котранспортера K + -C1-. J Biol Chem 1999; 274: 10661-10667.

19 Mount DB, Mercado A, Song L, Xu J, George AL Jr, Delpire E, Gamba G: Клонирование и характеристика KCC3 и KCC4, новых членов семейства катионно-хлоридных генов котранспортеров. J. Biol Chem., 1999; 274: 16355-16362.

20 Race JE, Makhlouf FN, Logue PJ, Wilson FH, Dunham PB, Holtzman EJ: Молекулярное клонирование и функциональная характеристика KCC3, нового котранспортера K-Cl.Am J Physiol 1999; 277: C1210-1219.

21 Payne JA: Котранспортеры хлорида калия: от клонирования к структуре и функциям .; inAlvarez-Leefmans FJ, Delpire E (eds): Физиология и патология переносчиков хлоридов и каналов в нервной системе: от молекул до болезней. Лондон, Academic Press, Incorporated, 2009, стр. 333-356.

22 Gagnon KB, Delpire E: Физиология транспортеров SLC12: уроки унаследованных генетических мутаций человека и генно-инженерных нокаутов мышей.Am J Physiol Cell Physiol 2013; 304: C693-714.

23 Ли Х, Хируг С., Цай К., Людвиг А., Блаесс П., Коликова Дж., Афзалов Р., Коулман С.К., Лаури С., Айраксинен М.С., Кейнанен К., Хируг Л., Саарма М., Кайла К., Ривера С.: KCC2 взаимодействует с дендритный цитоскелет, способствующий развитию позвоночника. Нейрон 2007; 56: 1019-1033.

DOI: 10.1159 / 000356621

и издательство Biochemistry pub

Ганьон / Ди Фульвио: молекулярный анализ котранспортеров K Cl

24 Horn Z, Ringstedt T, Blaesse P, Kaila K, Herlenius E: Преждевременная экспрессия KCC2 у эмбриональных мышей нарушает нервное развитие посредством независимого от ионного транспорта механизма.Eur J Neurosci 2010; 31: 2142-2155.

25 Wei WC, Akerman CJ, Newey SE, Pan J, Clinch NW, Jacob Y, Shen MR, Wilkins RJ, Ellory JC: Котранспортер 2 хлорида калия способствует миграции и инвазии клеток рака шейки матки с помощью независимого от транспорта ионов механизма. J. Physiol 2011; 589: 5349-5359.

26 Fiumelli H, BrinerA, Puskarjov M, Blaesse P, Belem BJ, Dayer AG, Kaila K, Martin JL, Vutskits L: независимая от ионного транспорта роль катранспортера хлорида KCC2 в дендритном спиногенезе InVivo.Cereb Cortex 2013; 23: 378-388.

27 Pellegrino CM, RybickiAC, Musto S, Nagel RL, Schwartz RS: Молекулярная идентификация и экспрессия котранспортера эритроидного K: C1 в эритролейкемических клетках человека и мыши. Клетки крови Mol Dis 1998; 24: 31-40.

28 Casula S, Shmukler BE, Wilhelm S, Stuart-Tilley AK, Su W, Chernova MN, Brugnara C, Alper SL: Доминантно-отрицательный мутант котранспортера KCC1 K-Cl: требуются как N-, так и C-концевые цитоплазматические домены на котранспортную активность K-Cl.J Biol Chem 2001; 276: 41870-41878.

29 Casula S, ZolotarevAS, Stuart-TilleyAK, Wilhelm S, Shmukler BE, Brugnara C, Alper SL: Исследования химического перекрестного связывания с котранспортером K-Cl мыши Keel. Клетки крови Mol Dis 2009; 42: 233-240.

30 Rust MB, Alper SL, Rudhard Y, Shmukler BE, Vicente R, Brugnara C, Trudel M, Jentsch TJ, Hubner CA: Нарушение котранспортеров эритроидного K-Cl изменяет объем эритроцитов и частично спасает дегидратацию эритроцитов у мышей SAD.Дж. Клин Инвест 2007; 117: 1708-1717.

31 Уваров П., Людвиг А., Маркканен М., Пруунсилд П., Кайла К., Дельпир Е., Тиммуск Т., Ривера С., Айраксинен М.С.: новая N-концевая изоформа нейрон-специфичного котранспортера K-Cl KCC2. J. Biol Chem 2007; 282: 30570-30576.

32 Song L, Mercado A, Vazquez N, Xie Q, Desai R, George AL Jr, Gamba G, Mount DB: молекулярная, функциональная и геномная характеристика человеческого KCC2, нейронального котранспортера K-Cl. Brain Res Mol Brain Res 2002; 103: 91-105.

33 Strausberg RL, Feingold EA, Grouse LH, Derge JG, Klausner RD, Collins FS, Wagner L, Shenmen CM, Schüler GD, Altschul SF, Zeeberg B, Buetow KH, Schaefer CF, Bhat NK, Hopkins RF, Jordan H, Мур Т., Макс С.И., Ван Дж., Се Ф., Дьяченко Л., Марусина К., Фармер А.А., Рубин Г.М., Хонг Л., Стэплтон М., Соарес М.Б., Боналдо М.Ф., Казавант Т.Л., Шетц Т.Э., Браунштейн М.Дж., Усдин Т.Б., Тошиюки С. , Carninci P, Prange C, Raha SS, Loquellano NA, Peters GJ, Abramson RD, Mullahy SJ, Bosak SA, McEwan PJ, McKernan KJ, Malek JA, Gunaratne PH, Richards S, Worley KC, Hale S, Garcia AM, Gay LJ, Hulyk SW, Villalon DK, Muzny DM, Sodergren EJ, Lu X, Gibbs RA, Fahey J, Helton E, Ketteman M, Madan A, Rodrigues S, Sanchez A, Whiting M, Madan A, Young AC, Shevchenko Y, Bouffard GG, Blakesley RW, Touchman JW, Green ED, Dickson MC, Rodriguez AC, Grimwood J, Schmutz J, Myers RM, Butterfield YS, Krzywinski MI, Skalska U, Smailus DE, Schnerch A, Schein JE, Jones SJ, Marra MA : Генерация и первичный анализ более 15,0 00 полноразмерных последовательностей кДНК человека и мыши.Proc Natl Acad SciUSA 2002; 99: 16899-16903.

34 Лауф П.К., Ди Фульвио М., Шривастава В., Шарма Н., Адрагна Северная Каролина: Экспрессия KCC2a в линии эпителиальных клеток хрусталика плода человека. Cell Physiol Biochem 2012; 29: 303-312.

35 Antrobus SP, Lytle C, Payne JA: K + -C1- котранспортер-2 KCC2 в кардиомиоцитах кур. Am J Physiol Cell Physiol 2012; 303: C1180-1191.

36 Taneera J, Jin Z, Jin Y, Muhammed SJ, Zhang E, Lang S, Salehi A, Korsgren 0, Renstrom E, Groop L, Birnir B: передача сигналов гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) в островках поджелудочной железы человека изменена по типу 2 сахарный диабет.Диабетология 2012; 55: 1985-1994.

37 Ди Фульвио М., Линкольн TM, Лауф П.К., Адрагна Северная Каролина: протеинкиназа G регулирует экспрессию котранспортера-3 хлорида калия в первичных культурах гладкомышечных клеток сосудов крысы. J Biol Chem 2001; 276: 21046-21052.

38 Мао С., Гарсон-Мувди Т., Ди Фульвио М., Чен Й, Дельпир Е., Альварес Ф. Дж., Альварес-Лифманс Ф. Дж .: Молекулярная и функциональная экспрессия котранспортеров катион-хлорида в нейронах ганглиев дорзального корешка во время постнатального созревания.Журнал Neurophysiol 2012; 108: 834-852.

39 Кале К.Т., Стейли К.Дж., Нахед Б.В., Гамба Г., Хеберт С.К., Лифтон Р.П., Маунт ДБ: Роль котранспортеров хлорида катионов в неврологических заболеваниях. Нат Клин Практ Нейрол 2008; 4: 490-503.

40 Blaesse P, Airaksinen MS, Rivera C, Kaila K: Котранспортеры хлористого катиона и функция нейронов. Нейрон 2009; 61: 820-838.

DOI: 10.1159 / 000356621

и издательство «Биохимия»: 8 декабря.2 ° 13

Ганьон / Ди Фульвио: молекулярный анализ котранспортеров K-Cl

41 Chamma I, Chevy Q, Poncer JC, Levi S: Роль нейронального ко-переносчика K-Cl KCC2 в тормозной и возбуждающей нейротрансмиссии. Front Cell Neurosci 2012; 6: 5.

42 Брауэр М., Фрей Е., Клас Л., Гриссмер С., Ягер Х: Влияние активности котранспортера K-Cl на активацию чувствительных к объему CI-каналов в человеческих остеобластах. Am J Physiol Cell Physiol 2003; 285: C22-30.

43 Канака С., Оно К., Окабе А., Курияма К., Ито Т., Фукуда А., Сато К. Дифференциальные паттерны экспрессии матричных РНК, кодирующих котранспортеры K-Cl (KCC1,2) и котранспортер Na-K-2C1 (NKCC1) в нервной системе крысы. Неврология 2001; 104: 933-946.

44 Mercado A, Broumand V, Zandi-Nejad K, EnckAH, Mount DB: C-концевой домен в KCC2 обеспечивает конститутивный K + -C1- котранспорт. J Biol Chem 2006; 281: 1016-1026.

45 Hubner CA, Stein V, Hermans-Borgmeyer I, Meyer T., Ballanyi K, Jentsch TJ: Нарушение KCC2 показывает существенную роль котранспорта K-Cl уже в раннем синаптическом торможении.Нейрон 2001; 30: 515-524.

46 Торнберг Дж., Войкар В., Савилахти Х., Раувала Х., Айраксинен М.С.: Поведенческие фенотипы гипоморфных мышей с дефицитом KCC2. Eur J Neurosci 2005; 21: 1327-1337.

47 Ву Н.С., Лу Дж., Англия Р., Макклеллан Р., Дюфур С., Маунт ДБ, Дойч А.Ю., Ловингер Д.М., Дельпир Е. Гипервозбудимость и эпилепсия, связанные с нарушением специфического для нейронов мышиного котранспортера K-Cl. Гиппокамп 2002; 12: 258-268.

48 Blaesse P, Guillemin I, Schindler J, Schweizer M, Delpire E, Khiroug L, Friauf E, Nothwang HG: Олигомеризация KCC2 коррелирует с развитием тормозной нейротрансмиссии.J. Neurosci 2006; 26: 10407-10419.

49 Уваров П., Людвиг А., Маркканен М., Сони С., Хубнер К.А., Ривера С., Айраксинен М.С.: Коэкспрессия и гетеромеризация двух изоформ котранспортеров нейронов K-Cl в головном мозге новорожденных. J Biol Chem 2009; 284: 13696-13704.

50 Mercado A, Vazquez N, Song L, Cortes R, Enck AH, Welch R, Delpire E, Gamba G, Mount DB: неоднородность Nh3-конца в котранспортере KCC3 K + -C1-. Am J Physiol Renal Physiol 2005; 289: F1246-1261.

51 Boettger T, Rust MB, Maier H, Seidenbecher T, Schweizer M, Keating DJ, Faulhaber J, Ehmke H, Pfeffer C, Scheel 0, Lemcke B, Horst J, Leuwer R, Pape HC, Volkl H, Hubner CA, Jentsch TJ: Потеря ко-переносчика K-Cl KCC3 вызывает глухоту, нейродегенерацию и снижение порога судорог.EMBO J 2003; 22: 5422-5434.

52 Rust MB, Faulhaber J, Budack MK, Pfeffer C, Maritzen T, Didie M, Beck FX, Boettger T, Schubert R, Ehmke H, Jentsch TJ, Hubner CA: нейрогенные механизмы способствуют развитию гипертонии у мышей с нарушением K -Cl котранспортер KCC3. Circ Res 2006; 98: 549-556.

53 Ding J, Ponce-Coria J, Delpire E: Мутант KCC3, дефицитный по незаконному обороту, обнаруживает доминантно-негативные эффекты на котранспортную функцию K-Cl. PLoS One 2013; 8: e61112.

54 Pan D, Kalfa TA, Wang D, Risinger M, Crable S, Ottlinger A, Chandra S, Mount DB, Hubner CA, Franco RS, Joiner CH: экспрессия генов котранспортера K-Cl во время дифференцировки эритроидов человека и мыши. Журнал биол. Химии 2011; 286: 30492-30503.

55 Rinehart J, Maksimova YD, Tanis JE, Stone KL, Hodson CA, Zhang J, Risinger M, Pan W, Wu D, Colangelo CM, Forbush B, Joiner CH, Gulcicek EE, Gallagher PG, Lifton RP: Сайты регулируемых фосфорилирование, которое контролирует активность котранспортера K-Cl.Cell 2009; 138: 525-536.

56 Fujii T, Takahashi Y, Itomi Y, Fujita K, Morii M, Tabuchi Y, Asano S, Tsukada K, Takeguchi N, Sakai H: K + -C1-Cotransporter-3a активирует Na +, K + -ATPase в липидных рафтах просветных париетальных клеток желудка. J Biol Chem 2008; 283: 6869-6877.

57 PearsonMM, LuJ, MountDB, Delpire E: Локализация котранспортера K (+) — Cl (-), KCC3, в центральной и периферической нервной системе: экспрессия в сосудистом сплетении, крупных нейронах и трактах белого вещества.Неврология 2001; 103: 481-491.

58 Becker M, Nothwang HG, FriaufE: Дифференциальный паттерн экспрессии переносчиков хлоридов NCC, NKCC2, KCC1, KCC3, KCC4 и AE3 в развивающемся стволе слухового мозга крысы. Cell Tissue Res 2003; 312: 155-165.

59 Ле Рузик П., Иванов Т.Р., Стэнли П.Дж., Бодуан Ф.М., Чан Ф., Пинто Э., Браун П.Д., Лакман С.М.: Экспрессия KCC3 и KCC4 в переднем мозге взрослых крыс. Brain Res 2006; 1110: 39-45.

60 Shekarabi M, Salin-Cantegrel A, Laganiere J, Gaudet R, Dion P, Rouleau GA: Клеточная экспрессия K + -C1-котранспортера KCC3 в центральной нервной системе мыши.Brain Res 2011; 1374: 15-26.

61 Lucas 0, Hilaire C, Delpire E, Scamps F: KCC3-зависимая экструзия хлоридов во взрослых сенсорных нейронах. Mol Cell Neurosci 2012; 50: 211-220.

62 Howard HC, Mount DB, Rochefort D, Byun N, Dupre N, Lu J, Fan X, Song L, Riviere JB, Prevost C, Horst J, SimonatiA, Lemcke B, Welch R, England R, Zhan FQ, Mercado A, SiesserWB, George AL Jr, McDonald MP, Bouchard JP, Mathieu J, Delpire E, Rouleau GA: Котранспортер K-Cl KCC3 является мутантом при тяжелой периферической нейропатии, связанной с генезом мозолистого тела.NatGenet2002; 32: 384-392.

DOI: 10.1159 / 000356621

и издательство Biochemistry pub

Ганьон / Ди Фульвио: молекулярный анализ котранспортеров K-Cl

63 Dupre N, Howard HC, Rouleau GA: Наследственная моторная и сенсорная невропатия с агенезией мозолистого тела; in Pagon RA, Adam MP, Bird TD, Dolan CR, Fong CT, Stephens K (ред.): GeneReviews. Вашингтонский университет, Сиэтл (Вашингтон), 1993.

64 Salin-Cantegrel A, Riviere JB, Shekarabi M, Rasheed S, Dacal S, Laganiere J, Gaudet R, Rochefort D, Lesca G, Gaspar C, Dion PA, Lapointe JY, Rouleau GA: транзитный дефект хлористого калия. -Транспортер 3 является основным патогенетическим механизмом наследственной моторной и сенсорной нейропатии с агенезом мозолистого тела. Журнал биол. Химии 2011; 286: 28456-28465.

65 Shekarabi M, Moldrich RX, Rasheed S, Salin-Cantegrel A, Laganiere J, Rochefort D, Hince P, Huot K, Gaudet R, Kurniawan N, Sotocinal SG, Ritchie J, Dion PA, Mogil JS, Richards LJ, Rouleau GA: Потеря нейронального котранспортера калия / хлорида 3 (KCC3) ответственна за дегенеративный фенотип в условной мышиной модели наследственной моторной и сенсорной нейропатии, связанной с агенезом мозолистого тела.J. Neurosci 2012; 32: 3865-3876.

66 Jiao Y, Jin X, Yan J, Zhang C, Jiao F, Li X, Roe BA, Mount DB, Gu W: делеционная мутация в Slcl2a6 связана с нервно-мышечным заболеванием у мышей gaxp. Геномика 2008; 91: 407-414.

67 Sun YT, Lin TS, Tzeng SF, Delpire E, Shen MR: Дефицит электронейтрального K + -C1- котранспортера 3 вызывает нарушение распространения импульса по периферическим нервам. Глия 2010; 58: 1544-1552.

68 Ди Фульвио М., Лауф П.К., Адрагна, Северная Каролина: сигнальный путь NO по-разному регулирует экспрессию мРНК KCC3a и KCC3b.Оксид азота 2003; 9: 165-171.

69 Di Fulvio M, Lauf PK, Shah S, Adragna NC: NONOates регулируют экспрессию мРНК котранспортера-1 и -3 KC1 в гладкомышечных клетках сосудов. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2003; 284: h2686-1692.

70 Adragna NC, Chen Y, Delpire E, Lauf PK, Morris M: гипертензия у мышей с нокаутом K-Cl cotransporter-3. Adv Exp Med Biol 2004; 559: 379-385.

71 HattoriA, Okumura K, Nagase T, Kikuno R, Hirosawa M, Ohara 0: характеристика длинных клонов кДНК из селезенки взрослого человека.ДНАРес 2000; 7: 357-366.

72 Chen YF, Chou CY, Wilkins RJ, Ellory JC, Mount DB, Shen MR: Зависящий от моторного белка мембранный перенос котранспортера-4 KCl важен для инвазии раковых клеток. Cancer Res 2009; 69: 8585-8593.

73 Weng TY, Chiu WT, Liu HS, Cheng HC, Shen MR, Mount DB, Chou CY: гликозилирование регулирует функцию и локализацию в мембране KCC4. Biochim Biophys Acta 2013; 1833: 1133-1146.

74 Карадшех М.Ф., Бьюн Н., Маунт Д.Б., Дельпир Е. Локализация котранспортера хлорида калия KCC4 в нервной системе.Неврология 2004; 123: 381-391.

75 Boettger T, Hubner CA, Maier H, Rust MB, Beck FX, Jentsch TJ: глухота и почечный канальцевый ацидоз у мышей, лишенных ко-транспортера K-Cl Kcc4. Природа 2002; 416: 874-878.

76 Mercado A, Song L, Vazquez N, Mount DB, Gamba G: Функциональное сравнение K + -C1- котранспортеров KCC1 и KCC4. J Biol Chem 2000; 275: 30326-30334.

77 Bergeron MJ, Gagnon E, Wallendorff B, Lapointe JY, Isenring P: Транспорт аммония и регулирование pH с помощью котранспортеров K (+) — Cl (-).Am J Physiol Renal Physiol 2003; 285: F68-78.

78 Fujii T, Takahashi Y, Ikari A, Morii M, Tabuchi Y, Tsukada K, Takeguchi N, Sakai H: Функциональная ассоциация между K + -C1- котранспортер-4 и H +, K + -АТФазой в апикальной канальцевой мембране теменной желудка. клетки. J Biol Chem 2009; 284: 619-629.

79 Hsu YM, Chou CY, Chen HH, Lee WY, Chen YF, Lin PW, Alper SL, Ellory JC, Shen MR: IGF-1 активирует электронейтральный котранспортер K-Cl KCC3 и KCC4, которые по-разному необходимы для пролиферации клеток рака груди и инвазивность.J. Cell Physiol 2007; 210: 626-636.

80 Arcaro A: Нацеленность на рецептор инсулиноподобного фактора роста-1 при раке человека. Front Pharmacol 2013; 4:30.

81 Гоффин Дж. Р., Збук К. Рецептор эпидермального фактора роста: путь, методы лечения и трубопровод. Clin Ther 2013; 35: 1282-1303.

82 Simard CF, Bergeron MJ, Frenette-Cotton R, Carpentier GA, Pelchat ME, Caron L, Isenring P: гомоолигомерные и гетероолигомерные ассоциации между изоформами котранспортеров K + -C1- и котранспортерами K + -C1- и Na + -K + -Cl- .J. Biol Chem. 2007; 282: 18083-18093.

83 Като К., Мисава К., Кума К., Мията Т.: MAFFT: новый метод быстрого множественного выравнивания последовательностей, основанный на быстром преобразовании Фурье. Nucleic Acids Res 2002; 30: 3059-3066.

84 Su AI, Wiltshire T, Batalov S, Lapp H, Ching KA, Block D, Zhang J, Soden R, Hayakawa M, Kreiman G, Cooke MP, Walker JR, Hogenesch JB: генный атлас белка мыши и человека -кодирование транскриптомов. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101: 6062-6067.

Авторские права: S. Karger AG, Базель 2013. Воспроизведено с разрешения S.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *