Столбчатый фундамент из блоков фбс: 🔨 где применяется, какие блоки, расчёт. Возведение своими руками. — АртСтрой — строительные материалы в Санкт-Петербурге

Содержание

Блоки под столбчатый фундамент: ФБС, как сделать

Столбчатый фундамент из блоков

Каждый фундамент, независимо от типа и строения, должен выдерживать большие нагрузки и стать отличным стабилизующим звеном между домом и грунтом. Но каждое основание отличается своей конструкцией, строением и эксплуатационными характеристиками. Соответственно, при выборе типа фундамента часто обращается внимание на стоимость возведении конструкций, а также тип и назначение сооружения. Не удивительно, что сейчас пользуются популярностью опорно-столбчатые фундаменты. Их другое название – столбчатые основания для небольших маловысотных зданий.

Столбчатый фундамент из блоков можно сделать своими руками за считанные дни, только он больше используется для возведения небольших компактных сооружений хозяйственного назначения. Выполняется практически с любых строительных материалов, но особенной популярностью пользуются готовые блоки фбс, которые можно купить на любом заводе железобетонных изделий. Как правило,тут используются конструкции типа фбс (монолитные с внутренним армированием) размерами 20х20х40 см.

Они отличаются небольшой массой, высокой надежностью и прочностью и стойкие к небольшим грунтовым подвижкам.

Конструкция фундамента из блоков ФБС

Установка столбчатого основания

Этот тип фундамента отличается от своих аналогов своей конструкцией и эксплуатационными характеристиками. Тут используются бетонные блоки фбс, которые служат несущим основанием для ленточного ростверка, на котором уже монтируются несущие стены. Учитывая большую площадь перекрытия столбчатого фундамента, он выдерживает большие нагрузки, но, через размеры блоков и сложность в их монтаже, используется ограниченное количество колонн. Соответственно, это свайный тип фундамента с колоннами, которые устанавливают только под углами пересечения несущих стен и в местах соединения всех стен. Столбчатый фундамент из блоков типа фбс можно сделать на практически всех типах грунтов, но не рекомендуется его возводить в горных сейсмически активных зонах через различное поведение грунтовых пластов. Ключевые составляющие столбчатого фундамента:

Бетонные блоки бфс;
Цементно-песчаный раствор;
Арматура.

Как выбрать бетонные блоки

Фундаментные блоки ФБС

Они должны выдерживать большие граничные нагрузки, причем при расчете сразу нужно определиться с типом и структурой будущего основания;
Нужно провести расчет максимально допустимой нагрузки на единицу площади перекрытия, учитывая характеристики и структуру грунта, а также допустимую максимальную массу самого здания;
Эксплуатационные характеристики блоков. Они должны быть морозостойкими, теплостойкими и при этом прочными на разрыв и деформацию.
Наличие в несущих конструкциях наполнителей. Оптимально – это наличие гранитного щебня малой фракции, способного выдерживать высокие нагрузки. Можно также использовать песчаник или базальт, но базальт слишком эластичен, ведь имеет ровные плавные формы, а песчаник рыхлый, но плотный с воздушными карманами.

Этапы возведения столбчатого фундамента

Фото фундаментов из ФБС
Разметка территории будущей строительной площадки, фиксирование мест расположения несущих бетонных опор;
Подготовка площадки, выравнивание почвы, формирование маяков для столбов;
Разбивка фундамента;
Монтаж блоков фбс, соединение блоков между собой;
Установка опалубки, монтаж внешней гидроизоляции и теплоизоляции при необходимости;
Монтаж блоков, соединение их между собой с помощью горизонтальных и вертикальных арматурных прутьев, а также с использованием бетонного раствора;
Создание ростверка поверх бетонных столбов.

Как правило, для возведения столбчатого фундамента используются бетонные конструкции типа фбс, потому что это один из самых дешевых и доступных вариантов блоков. Их можно сделать прямо на строительной площадке, но это не рекомендуется, ведь не будут соблюдены строительные нормы. Это монолитные конструкции небольшого размера, производятся в промышленных масштабах, имеют внутреннего армирование без внешнего контакта. Такие конструкции способны выдерживать большие нагрузки, но, из-за своей монолитной структуры, отличаются эластичностью, поэтому без дополнительного армирования тут не обойтись. Блоки фбс рекомендуется подбирать строго по готовому проекту, ведь они могут иметь различные размеры, хотя укладка производится в шахматном порядке. Но даже тут есть свой нюанс.

Это ленточная конструкция, поэтому блоки фбс должны быть установлены не только правильно, тут нужно предусмотреть дополнительное армирование несущего основания и соединение с верхней частью стен или цокольным этажом.

Почему стоит выбирать столбчатые фундаменты с фбс?

Минимальные, средние и максимальные размеры блоков ФБС

Высокая несущая способность. Фундамент не склонен к подвижкам, основание и верхняя часть имеют одинаковые размеры, поэтому распределение тяжести также равномерное;
Столбы устанавливаются только на угловых соединениях стен и на промежуточных треугольниках, нет нужды устанавливать их как опоры для локальных панелей ростверка;
Это дешевый строительный материал, причем производится в промышленных масштабах, где контролируется каждый этап производства и есть контроль качества;
Можно возвести основание за считанные дни;
Он способен выдержать сезонные подвижки почвы, а также проседание почвы за счет локального возникновения грунтовых горизонтов.

Недостатки:

Все блоки фбс имеют большую массу, поэтому довольно сложно их устанавливать вручную.
Бетон не отличается высокими теплоизоляционными свойствами, поэтому без теплоизоляции не обойтись.
Также нужно делать гидроизоляцию фундамента.

Нельзя построить подвальный этаж.

Современные столбчатые фундаменты из блоков фбс – это отличное решение для малотоннажных зданий. Они способны заменить винтовые сваи или буронабивные сваи в случае оперативного ремонта фундамента, но стоимость возведения такого основания довольно высокая. Поэтому, сначала стоит сделать подробный расчет допустимых нагрузок на единицу площади с учетом характеристик почвы. Это отличное решение при возведении хозяйственных построек малой высоты, учитывая небольшие нагрузки, но использовать этот тип фундамента на рыхлых почвах строго запрещено через возможность просадки одного бетонного столба через сыпучий грунт и саму большую массу конструкции.

Столбчатый фундамент из блоков своими руками

Столбчатый фундамент из блоков является оптимальным решением для строительных работ маленьких зданий, бань и сараев. Если сделать монтаж правильно, то можно добиться максимального уменьшения нагрузки на почвенный слой. Стоит отметить, что данный тип основания имеет достаточно маленькие затраты и при этом высокий уровень качества. В нашей статье мы ознакомимся подробнее с особенностями таких фундаментов.

Назначение фундамента

Столбчатый фундамент из блоков является оптимальным решением для строительных работ маленьких зданий, бань и сараев

Любое строительство дома своими руками начинается с закладки основания. Главное целью данного элемента конструкции является транспортировка объёма нагрузки на почвы. Монтажные работы фундамента дело требующее больших затрат, но на сегодняшний день есть множество вариантов экономии. Одной из недорогих технологий и есть блочная система.

Стоит отметить, столбчатый фундамент из блоков имеет огромное количество достоинств перед другими типами построек. К таким характеристикам относятся следующие показатели:

Высокий показатель прочности строения;
Устойчивость от воздействия агрессивной среды;
Стойкость к морозу;
Долгая эксплуатационная возможность;
Низкая стоимость;
Большой ассортимент изделий из железобетона;
Разнообразие размеров и габаритов деталей, поэтому можно подобрать нужную величину.

Внимание! Именно по таким плюсам многие специалисты и останавливаются на таком виде фундамента. Плюс ко всему необходимо отметить, что на строительные работы уходит небольшое количество времени.

Виды фундаментов из блоков

Основание из бетона – это один из самых популярных типов построек такого назначения

Основание из бетона – это один из самых популярных типов построек такого назначения. В большинстве случаев встречаются такие фундаменты в строительных проектах небольших построек. Это такие объекты, как бани, хозяйственные здания, цехи, маленькие строения и т.д. Выполняя расчет величины глубины необходимо обязательно брать во внимание особенности почвы. По критерию относительно уровня промерзания они бывают такой разновидности:

Заглубленные виды – глубина такой закладки 1 метр ниже уровня промерзания земли. Стоит отметить, что их применение актуально на участках глинистых почв.
Малозаглубленный фундамент из бетона – погружается на глубину до 0,7 метра. Такое основание обычно встречается на песчаных и скалистых участках.

Если рассматривать строительную технику для выполнения данного типа строения, можно использовать два существующих способа:

Подушечный метод;
Стеновая техника.

Первый тип по своей форме напоминает трапецию. Особенность такого основания заключается в способности увеличивать территорию опоры. Чаще всего такую технику можно увидеть при обустройстве первого ряда подошвы. Стоит отметить, что именно такой подход может обеспечить максимальный уровень устойчивости строительного объекта.

Метод стеновой конструкции имеет четырехугольную форму. В некоторых случаях делаются специальные вырезы по бокам, которые необходимы для организации максимальных стыков. Блоки из бетона применяются для подземного и наружного устройства основания. На сегодняшний день существует еще одна классификация блоков, которые разделяются по признаку заглубления:

Рекомендуем к прочтению:

Цельные установки без отверстия – ФБС;
Конструкции, имеющие прорезы для выхода коммуникации – ФБВ;
Блоки П-образного строения – ФБП.

Внимание! Очень важным моментом является наличие отверстий для проложения коммуникационной система. В противном случае вам придётся делать их своими руками.

Монтаж своими руками

Для выполнения основания из бетона своими руками лучше выбирать блоки 20 на 20 на 40 см

Столбчатый фундамент из блоков выполняется такими же действиями, как и для других материалов. Первое, что нужно выполнить – это произвести расчеты и поставить все необходимые отметки. Стоит учесть. Что должны располагаться во всех уголках и пересечениях стен. Расстояние от одного столба к другому должно не превышать 3 метра. Если не соответствовать этой норме, то может образоваться деформация конструкции.

Для выполнения основания из бетона своими руками лучше выбирать блоки 20 на 20 на 40 см. Плюс к этому, можно использовать полнотелые или пустотелые типы. Все детали конструкции скрепляются между собой раствором из цемента.

Внимание! Если выполняется постройка легкого здания, то можно не использовать раствор, а просто выкладывать плиты одну на одну.

Выполняя монтаж из бетона делать скрепление блочных элементов в определенной последовательности. Такое основание имеет стойкость к высокому объёму нагрузки. Это происходит благодаря наличию в конструкции ростверка, который распределяет давление между сваями. Своими руками его можно сделать в таких видах:

Объединением оголовок свай, что образует плиты;
Основание, где соединение происходит между соседними сваями.

Внимание! Самым оптимальным вариантом есть создание монолитного ростверка из железобетона. Такой тип имеет высокую практичность и легкую возбудимость.

Завершающим этапом являются такие действия настила гидроизоляции и укладка бруса. Это очень необходимые процессы, поэтому давайте ознакомимся с ними подробнее.

Рассчитываем нагрузку

Необходимым действием для строительных работ фундамента из бетона своими руками считается выполнение расчётов его нагрузочной способности

Необходимым действием для строительных работ фундамента из бетона своими руками считается выполнение расчётов его нагрузочной способности при разных сезонах года. Эта необходимость возникает из-за возможности разрушений при большом весе зданий. Так, если вы планируете, монтаж небольшого помещения, то вам идеально подойдет столбчатое основание.

Как же определить величину нагрузки? Для этого нужно учитывать предельный уровень нагрузки на 1 куб. см, который равняется 0,5 кг. Стоит учесть, что такие показания применимы для торфяного или высушенного участка. Если вычисления показывают, что давление вашей постройки вкладывается в поставленные рамки, то вы смело можете устанавливать такой фундамент своими руками.

Внимание! При таких математических действиях нужно брать во внимание такие показатели: все значения масс постройки, мебели, фундамента, снега и ветра.

Большинство таких значений вы найдете в вашем проекте, который должен иметь все данные об особенностях климатических характеристик в вашем регионе. В том случае, когда все монтажные работы вы выполняете самостоятельно, то и расчет должен выполняться вами своими руками. Стоит учесть, что комфортнее и надежнее все-таки доверить все работу специалистам, так как от правильного определения величин зависит устойчивость и долговечность конструкции.

Рекомендуем к прочтению:

Определяем уровень промерзания почвы и поверхностных вод

Данная величина актуальна для расчета значения глубины закладки основания

Данная величина актуальна для расчета значения глубины закладки основания. Такие цифры можно легко найти в справочных материалах. Далее вам следует придерживаться основного правила, что фундамент из бетона должен располагаться ниже на 0,4 метра, чем показатель уровня промерзания земли.

Внимание! Если уровень промерзания почвы достигает полметра, то основание постройки должно закладываться на глубину 0,9 метра.

Помимо этого фактора, при строительных работах необходимо брать во внимание, где протекают поверхностные воды. Существует такое требование: чем выше водный поток, тем ниже должна осуществляться закладка конструкции. Так, например, если участок земли очень насыщен поверхностными водами, то фундамент может погружаться и на два метра.

Выполняем расчет материалов

Для того чтоб выяснить количество столбов для постройки основания своими руками следует учитывать некоторые данные

Получив вышеперечисленные данные можно начинать определять, сколько же материалов вам пригодится для данных работ. Выполнять такую задачу следует, отталкиваясь от объёма нагрузок. Итак, для того чтоб выяснить количество столбов для воспроизведения основания своими руками следует учитывать следующие данные:

Столб необходимо устанавливать под всеми углами наружной части постройки;
На каждом соединении внутренней перегородки;
Расстояние между ними должно варьироваться от 1,5 до 2 метров;
Величина высоты должна превышать на 15 см уровень земли. Эта норма необходима для будущего монтажа на них ростверка.

Внимание! Следует брать во внимание песчаную подушку, ингредиенты на раствор и материалы для гидроизоляции.

Разметка территории

Устанавливаем разметки столбов, которые должны быть идентичными с планом проекта

При выполнении строительных работ по возведению фундамента из бетона следует придерживаться такой пошаговой инструкции:

Выполняем очистку площади от верхнего слоя земли, соблюдая глубину 15 см. Можно также избавить территорию под домом от флоры.
Совершаем выравнивание участка;
Далее устанавливаем разметки столбов, которые должны быть идентичными с планом проекта. Стоит учесть, что можно применять арматуру или обрезок труби, которые нужно позабивать по намеченным точкам.
Проверяем соответствие всех величин и углов. При совершении всех действий следует соблюдать дистанцию между объектами 1,5 – 2 метра.

Бур отверстий

Стоит отметить, что данную строительную задачу выполняют специальным аппаратом – буром

Последующим этапом работ есть создание ям под блоки. Стоит отметить, что данную строительную задачу выполняют специальным аппаратом – буром, и размеры углублений должны быть шире, чем бетонные плиты, так как будет выполняться гидроизоляция. При небольшой глубине, величину необходимо увеличивать на 15 см с каждой стороны.

Внимание! Если показатель глубины превышает отметку метра, яму нужно сделать более широкой. Чтоб легко можно было выполнить штукатурку. После окончания данного процесса нужно утрамбовать землю.

Укладывание блоков в столбы

Следующим действием есть выкладывание блоков на вязкий раствор из бетона. Учтите, что постоянно необходимо следить за возведением столбов по вертикали, потому, что потом исправить это будет сложно и очень дорого. Чтоб выполнить этот процесс правильно, нужно применять такие инструменты, как уровень, отвес и нитку.

Внимание! В случае высоты столба больше метра, его установку нужно выполнять при помощи опалубки.

Гидроизоляция

Чтоб повысить прочность будущего здания, нужно выполнять герметизацию

Чтоб повысить прочность будущего здания, нужно выполнять герметизацию всех стыков в конструкции. Выполнить данное действие можно при помощи мастики, пленки или мембраны. В случаи применения мастики нужно ждать ее полного высыхания, а потом уже продолжать работу. Данная норма позволить не потерять целостность постройки.

Внимание! Пустоту между основанием и стенками скважины нужно заполнять землей, а потом утрамбовывать ее.

Столбчатый фундамент из блоков мелкозаглубленный. Плюсы и минусы

Мелкозаглублённые основания столбчатого типа часто используются в частном строительстве

По сути, столбчатое основание – это сетка из вертикальных опор с минимально возможным поперечным сечением. Опоры устанавливаются во всех точках здания, где сосредотачиваются максимальные нагрузки (по углам, на пересечении стен, под колоннами, простенками, несущими балками, в месте обустройства печи или камина).

Мелкозаглублённые основания столбчатого типа часто используются в частном строительстве. Они подходят для лёгких каркасных строений, деревянных построек без подвалов, которые несильно нагружают грунт. Такие конструкции простые в исполнении и относительно недорогие.

Важно: столбчатое основание идеально подходит для лёгких построек весом не больше 1 т/м³. К ним относятся каркасные дома, деревянные бани, садовые и гостевые домики, хозяйственные постройки, навесы, террасы, беседки, летние кухни и т.п.

К преимуществам таких конструкций можно отнести следующее:

Монтаж, проектировка и расчёт могут выполняться собственноручно без привлечения специалистов и строительной техники.
Такие конструкции можно использовать на любых почвах, за исключением пучинистых грунтов и территорий с высоким УГВ.
Столбчатые фундаменты можно применять на склонах и на участках с большим перепадом высот.
Для выполнения такого основания не нужно проводить выравнивание территории.
Скорость монтажа значительно превосходит сроки создания других оснований.
Не нужно обустраивать сложную и дорогую гидроизоляцию.
Срок службы столбчатого фундамента значительный (до 50-70 лет).
Расходы на обустройство всей конструкции небольшие.

Недостатков у таких конструкций хоть и немного, но они есть:

Мелкозаглублённый столбчатый фундамент нельзя обустраивать при возведении стен из кирпича, железобетона, природного камня. Они также не подходят для многоэтажных строений.
При выполнении такого фундамента не получится организовать подвальные помещения.

Как выровнять столбчатый фундамент из блоков. Возведение блочного столбчатого основания

Столбчатый фундамент из блоков своими руками довольно прост в обустройстве. Блоки, связываемые бетонным раствором, устанавливаются на основание из щебня и песка. Конечно, такой тип несущей конструкции является весьма удобным и простым в строительстве, однако существует несколько серьёзных ограничений по его обустройству:

столбчатая основа из блоков не может быть возведена на подвижных пучинистых почвах;
блочный столбчатый фундамент нельзя строить на слабых типах грунтов: глинистая почва, торф;
такой фундамент не подойдёт в случае возведения массивных строений.

Достаточно сложным процессом также является обшивка цокольного пространства под возведённым на блочном столбчатом фундаменте домом.

Технология опорно-столбчатого основания

Чтобы обустроить опорно-столбчатый фундамент, необходимо по всему периметру строения, а также под несущими балками установить столбы из бетона с параметрами 40х40х40 см. через каждые три метра. Для формирования каждой опорной точки потребуется 4 блока размерами 20х20х40 см. Поверх блоков кладётся рубероид, который служит гидроизоляцией. Чтобы устроить прочный столбчатый фундамент из блоков 20х20х40 см. для дома 6×6 м., потребуется сделать всего 12-16 опорных точек (столбов).

Обычно подобное основание часто выбирается как столбчатый фундамент для бани или для бытовки. Ведь строительство несложно и достаточно экономично, плюс ко всему не требуется дополнительная гидроизоляция. Подобный фундамент также может быть отличной основой для лёгких каркасных домов, которые не имеют погребов и подвалов.

Мелкозаглубленный столбчатый фундамент. Плюсы и минусы

Мелкозаглублённые основания столбчатого типа часто используются в частном строительстве

К преимуществам таких конструкций можно отнести следующее:

Монтаж, проектировка и расчёт могут выполняться собственноручно без привлечения специалистов и строительной техники.
Такие конструкции можно использовать на любых почвах, за исключением пучинистых грунтов и территорий с высоким УГВ.
Столбчатые фундаменты можно применять на склонах и на участках с большим перепадом высот.
Для выполнения такого основания не нужно проводить выравнивание территории.
Скорость монтажа значительно превосходит сроки создания других оснований.
Не нужно обустраивать сложную и дорогую гидроизоляцию.
Срок службы столбчатого фундамента значительный (до 50-70 лет).
Расходы на обустройство всей конструкции небольшие.

Недостатков у таких конструкций хоть и немного, но они есть:

Мелкозаглублённый столбчатый фундамент нельзя обустраивать при возведении стен из кирпича, железобетона, природного камня. Они также не подходят для многоэтажных строений.
При выполнении такого фундамента не получится организовать подвальные помещения.

Источник: https://interer-stil.ru-land.com/stati/fundament-stolbchatyy-vidy-stolbchatogo-fundamenta

Столбчатый фундамент из блоков фбс. Область применения

Основная сфера применения столбчатых фундаментов из ФБС блоков — частное строительство. Такие основания не отличаются высокой несущей способностью, вследствие чего потенциал их эксплуатации существенно ограничен.

На не склонной к пучению либо слабопучинистой почве на столбчатых фундаментах из блоков могут возводится небольшие каркасные, деревянные либо щитовые постройки — одноэтажные дома, бани, хозяйственные помещения.

Рис. 1.2 : Деревянный дом на столбчатом фундаменте

Если строительство ведется в регионе с песчаными, плотными скальными либо крупнообломочными (гравийными, валунными и галечниковыми) грунтами, несущих характеристик столбчатого ФБС фундамента будет достаточно для строительства полноценных домов из сруба, бруса или пенобетона.

Рис 1.3 : Схема столбчатого фундамента из ФБС

Совет эксперта ! Столбчатый фундамент из ФБС блоков не предусматривает возможности обустройства подвала, если для вас этот критерий важен — обратите внимания на другие виды оснований.

Оптимальная глубина заложения столбчатого фундамента из ФБС (и любых сборных конструкций) — до одного метра, если условия строительства (тип грунта, масса дома) требуют большей глубины заложения, рациональнее обустраивать столбчатые фундамента из заполненных бетоном асбоцементных труб, поскольку закладка ФБС блоков на глубину свыше 1-го метра является крайне трудоемким процессом.

Столбчатый фундамент из ФБС блоков не рекомендуется возводить в следующих ситуациях:

Следует учесть, что указанные достоинства проявляются лишь при приобретении фундаментных блоков высокого качества. Стеновые или пустотелые изделия подходят лишь для щитовых времянок, специалисты их покупать не советуют.

Устройство фундамента из блоков

Ввиду многообразия конструкционных материалов фундамент из блоков бывает из бетонных изделий ФБС либо стеновых материалов размером 4 х 2 х 2 дм. Технологии несколько отличаются, эксплуатационные характеристики подземных несущих конструкций не одинаковы. Все нюансы, рассмотренные в этом руководстве, будут полезны индивидуальным застройщикам.

Из каких блоков можно построить фундамент?

При выборе стройматериала следует учесть, что все блоки внутри сборной фундаментной ленты являются шарнирно закрепленными балками с двумя степенями подвижности как минимум. Поэтому, чем крупнее формат бетонных изделий, тем прочнее фундамент из блоков, стабильнее его пространственная геометрия. Промышленность выпускает несколько модификаций изделий:

ФБС – крупный формат, укладываются на плиты ФЛ краном, имеются блоки с пустотами ФБП и с вырезами для прокладки коммуникаций ФБВ

стеновой блок/камень бетонный – формат мелкий, укладываются вручную, для подземных конструкций применяются только полнотелые модификации

Внимание: Некоторые производители реализуют блоки без пустот, как ФБС 2-2-4, ссылаясь на собственные техусловия. В ГОСТ подобные изделия не писаны, поэтому качество сертифицируется по стандартам блоков для цоколей, стеновой кладки.

Размеры ФБС соответствуют – длина 24, 12 или 9 дм, ширина 3 – 6 дм, высота 3 дм или 6 дм. Стеновые блоки имеют габариты 2 х 2 х 4 дм, заменяют семь типовых кирпичей. В отличие от кирпичной кладки бетон обладает в подземных конструкциях большим ресурсом, позволяет снизить бюджет строительства.

Поэтому при наличии подъезда для спецтехники рекомендуется выбрать ФБС, в плотной застройке, когда кран невозможно загнать в пятно застройки, остается вариант сборного фундамента из мелкоформатных блоков.

Блок фундаментный

Прочность ФБС из пескобетона соответствует В12,5 – В15, из легких/тяжелых бетонов В3,5 – В15. Промышленный способ изготовления обеспечивает унифицированные размеры, одинаковое расположение монтажных петель, стабильную геометрию, отсутствие внутренних пор.

Внимание: ФБС блоки армировании не имеют, поэтому их размещают внутри армированных элементов фундамента – плиты ФЛ снизу + армопояс монолитный по верху последнего ряда.

Полностью избавиться от монолитных работ застройщику не удастся в любом случае. Строительство стен возможно после набора прочности армопоясом, то есть выигрыш во времени обеспечивается только за счет снижения опалубочных, арматурных, бетонных, распалубочных работ. Востребован ЛФ из ФБС блоков в случаях:

сокращение времени строительства
снижение трудозатрат в лентах глубокого заложения
обеспечение демонтажа для мобильных зданий

Для укладки ФБС блоков существуют карты ТТК, в которых описана последовательность работ.

Блок стеновой

Согласно СП 22.13330, ширина сборного фундамента должна превышать 0,4 м, поэтому при использовании стеновых блоков кладка ведется в один блок минимум. Не рекомендованы для подземных конструкций бетоны с влагопроницаемыми наполнителями (опилки, керамзит, ракушечник). Запрещена кладка фундамента из пустотных/щелевых блоков, так как это нарушает распределение сборных нагрузок от здания на грунты.

В сравнении с кирпичной кладкой сборный ленточный фундамент получает повышенный ресурс. Однако надежность по умолчанию значительно ниже монолитных конструкций. Поэтому применяется данная технология в случаях:

легкая постройка из панелей СИП, пенобетона, газоблоков, по технологии сруба, каркасника
сухие грунты с высоким расчетным сопротивлением

Соблюдение технологий, позволяющих снизить/ликвидировать морозное вспучивание, является обязательным условием для сборных фундаментов.

Технология возведения

Любой сборный фундамент из блоков возводится методом кладки отдельных элементов с порядной перевязкой вертикальных швов. Реже используется методика разряженной укладки готовых бетонных изделий, замоноличивание участков между ними товарным бетоном в опалубку. Для уширения подошвы используются плиты для крупноформатных ФБС блоков, подбетонка для блоков 2 х 2 х 4 дм.

Основными ошибками строительства являются:

отсутствие гидроизоляции – бетон впитывает влагу из прилежащих техногенных зон, образованных материалами обратных засыпок и подстилающих слоев из щебня, песка, обладающих высокой проникающей способностью
отсутствие утеплителя – теплоизоляция отмостки и наружной поверхности ленты приводит к промерзанию прилежащих к фундаменту грунтов, возникновению вспучивания
отсутствие дренажа – верховодка, талые, дождевые воды насыщают глинистые почвы, возникают силы пучения

Для укладки блоков могут использоваться разные растворы:

монтажные – наполнителем является песок мелкой фракции, смесь качественнее заполняет пустоты, обеспечивает более стабильную геометрию
кладочные – изготавливаются из крупного песка, стоят дороже, менее пластичны, поэтому в состав вводят Суперпластификатор

Из ФБС блоков обычно сооружают фундаменты ленточные, стеновые блоки 2 х 2 х 4 дм используются, как для МЗЛФ, так и для столбчатых фундаментов.

Ленточный фундамент

Для укладки крупногабаритных блоков понадобится грузоподъемная техника. Предварительно должна быть составлена схема их взаимного расположения. Технологические проемы необходимы для узлов ввода коммуникаций, вентиляционных продухов. Блоков с отверстиями не существует, поэтому между ними оставляют щели, закладываемые позже кирпичом.

Ленты из блоков 2 х 2 х 4 дм возводятся вручную, что позволяет снизить бюджет строительства. Гильзы для прохождения труб сразу вмуровываются в кладку, окна вентиляционных продухов имеют проектный размер.

Монтаж ФБС блоков

После определения несущей способности подземной конструкции и выбора типоразмера ФБС фундамент из блоков изготавливается по технологии:

разметка – оси не выносятся, шнуры натягиваются по наружной грани ленты
выемка грунта – траншеи для МЗЛФ или котлован для ленты глубокого заложения
подстилающий слой – 40 – 60 см щебня при высоком УГВ либо песка на сухих грунтах
дренаж – по наружному периметру отмостки монтируются в углах смотровые колодцы, соединенные в единый замкнутый контур перфорированными трубами с уклоном для самотечного перемещения стоков в подземный резервуар
гидроизоляция подошвы – поверх подстилающего слоя укладывается полиэтилен или 2 слоя рубероида
монтаж плит – изделия ФЛ укладываются вплотную или с промежутками, которые заполняются бетоном либо утрамбованным песком

укладка блоков – начиная от углов, затем в местах примыкания, после чего, заполняются прямые участки согласно схемы

армопояс – на верхний ряд монтируется опалубка, укладывается арматурный каркас, обвязанный в сопряжениях стен анкерами
гидроизоляция наружная – все доступные бетонные поверхности после распалубки армокаркаса покрываются проникающей, оклеечной, штукатурной или обмазочной гидроизоляцией

Внимание: Отмостка не является элементом фундамента, однако предохраняет прилегающие к нему грунты от излишнего намокания. Для эффективного отвода поверхностных стоков рекомендуется встраивать во внешний периметр отмостки лотки и дождеприемники ливневки.

Поверх гидроизоляции наружные грани ленты оклеиваются экструдированным пенополистиролом, под отмосткой выстилается лента из этого же материала на глубине 40 см или подошвы МЗЛФ. Обратная засыпка производится инертными материалами, слои которого уплотняются виброплитой.

Кладка из блоков 40 х 20 х 20

При выборе мелкоформатных бетонных изделий для сооружения ленточного фундамента технология изменяется. Разметка, выемка грунта, дренаж и изготовление подстилающего слоя производятся по стандартной методике. Затем следуют операции:

подбетонка – стяжка 5 – 10 см из тощего бетона, ширина которой равна подстилающему слою (вдвое больше размера ленты)
гидроизоляция – рулонные материалы наплавляются битумным слоем на подбетонку, полимерные пленки приклеиваются к ее поверхности
кладка – классическая по аналогии с кирпичной, ряды перевязываются сетками, смещением вертикальных швов, чередованием тычка/ложка

Армопояс, гидроизоляция, утепление отмостки и наружных стен фундамента полностью идентичны предыдущему случаю.

Столбчатый фундамент

Для деревянных построек часто используется сборный фундамент из блоков 2 х 2 х 4 дм. Глубина заложения на супесях, суглинках составляет 20 – 40 см, в песок, крупный гравий, осколочный грунт столбы можно не заглублять. Минимальное сечение регламентировано в СП, как 4 х 4 дм, количество и шаг столбов выбирается при расчете несущей способности.

Внимание: Для достижения максимально возможного ресурса рекомендуется пристенный дренаж, ливневка, интегрированная в отмостку, забирка.

Натурный вынос осей необходим для обозначения шнурами боковых поверхностей столбов. Объем земляных работ зависит от геологических условий:

плодородную почву необходимо полностью снять
если сборные нагрузки дома не велики (каркасник, панели СИП, фахверк), для каждого столба отрывается шурф глубиной 0,6 – 1 м
для сруба, газобетонных стен проще вырыть траншеи под несущими стенами, так как снижается расстояние между столбами для обеспечения несущей способности фундамента

Котлованы для столбчатых фундаментов экономически невыгодны, так как эта подземная конструкция не пригодна для подвальных этажей. При изготовлении подстилающего слоя нужно учесть:

размеры для каждого столба вдвое больше его сечения
глубина щебеночной или песчаной подсыпки 40 см
для повышения площади опирания под каждой стойкой заливается 30 см плита, армированная сеткой
рулонная гидроизоляция укладывается под плиту, края рубероида приклеиваются к ее боковым граням после распалубки
под столб снова укладывается гидроизоляционный материал

Обычно применяются столбы сечением 4 х 4 дм, что позволяет перевязывать каждый ряд. Обвязка верхним ростверком для столбчатых фундаментов обязательна. Она обеспечивает стабильность пространственной геометрии, обеспечивает жесткую связь всех элементов конструкции, предотвращает выдергивание силами пучения отдельных стоек.

Сборные столбчатые фундаменты не рекомендуется оставлять в зиму без нагрузки, даже при наличии ростверка.

Таким образом, из блоков ФБС можно изготовить ленточный фундамент. Используя блоки 2 х 2 х 4 дм, появляется возможность строительства, как МЗЛФ, так и столбчатого фундамента легких построек.

Фундамент из блоков 20х20х40: разновидности и сфера применения

Дата: 13 июня 2018

Коментариев: 0

Для обеспечения устойчивости зданий строители сооружают фундаментные основы различной конструкции. Важно при постройке основания обеспечить надежность фундамента, определяющего ресурс эксплуатации строения. Фундамент, типы и виды которого отличаются, должен подбираться с учетом концентрации влаги в грунтах и массы строения. Достаточно распространенное решение – заглубленный столбчатый фундамент из блоков 20х20х40. Он отличается прочностью и способен выдержать дополнительную нагрузку, которая возникает, если производится усиление перекрытий.

Основания столбчатого типа – разновидности фундаментов

Столбчатые основания положительно зарекомендовали себя при возведении зданий облегченного типа на основе деревянных брусьев, бревен или готовых каркасов. Основы столбчатой конструкции эффективны на плотных грунтах со значительным уровнем промерзания. При необходимости возведения зданий на пучинистых почвах, столбчатая база является единственно верным вариантом. Фундаментные основы отличаются конструкциями, а также применяемыми для их возведения материалами.

Правильный подход к выбору типа основы дома позволит сделать постройку крепкой и рационально расходовать средства на строительство

Для изготовления могут использоваться следующие стройматериалы:

природный камень;
обожженный кирпич;
бетонные блоки;
деревянные столбы;
железобетонные колонны;
металлические профили;
асбоцементные трубы.

Для обеспечения устойчивости стен здания важно предварительно выполнить расчет, а при изготовлении выдержать вертикальность опорных колонн и обеспечить требуемую площадь сечения опор в зависимости от применяемых материалов.

Важно соблюдать требования по минимальным размерам опорных поверхностей в зависимости от применяемых материалов:

бутовый камень – 60х60 см;
бутобетон – 40х40 см;
железобетон – 30х30 см;
кирпич – 50х50 см;
деревянные брусья – 20-40 см;
асбоцементные трубы – диаметр 20 см;
фундаментные блоки – 40х40 см.

После извлечения грунта и формирования приямков в каждой формируется демпферная подушка, которая укладывается на спланированное основание. Она выполняется на основе необходимого количества перемешанного песка и щебня. Затем подсыпка увлажняется и трамбуется.

Небольшие постройки, каркасные дома и малоэтажные строения возводят на опорно-столбчатом фундаменте

На этом подготовка заканчивается и сооружается один из следующих типов столбчатых фундаментов:

блочный. Он изготавливается из стандартных бетонных или усиленных железобетонных блоков. Укладку блоков выполняют с помощью цементного раствора;
бетонный. При его сооружении каркас щитовой опалубки с арматурной решеткой заливают предварительно подготовленным бетонным раствором;
кирпичный или бутовый. Применяемый для его изготовления каменный стройматериал бетонируется связующей цементной смесью;
трубчатый. Он отличается использованием труб из металла или асбоцемента в качестве опорных элементов. Нижний уровень труб располагается на большой глубине;
деревянный. Его основу составляют пропитанные антисептическим составом опорные балки из древесины. При этом важно гидроизолировать находящуюся в грунте часть бруса.

Принятие решения о выборе стройматериала для изготовления столбчатого фундамента осуществляется после расчета его нагрузочной способности, учитывающей вес здания и характер грунта. При повышенной концентрации в грунте крупного песка и глинистой фракции целесообразно отдать предпочтение столбчатому фундаменту. Опорные колонны отличаются разнообразием форм в поперечном сечении. Они изготавливаются круглыми, квадратными или прямоугольными.

Решив сооружать столбчатое основание, помните, что его конструкция не позволяет обустроить подвальное помещение. Однако свободное пространство обеспечивает возможность беспрепятственного расположения под полом здания электрических, канализационных и других коммуникаций.

В каких случаях не стоит выполнять фундамент из блоков 20х20х40 марки ФБС

Не всегда конструктивные особенности здания и характер почвы позволяют использовать столбчатый фундамент на основе блоков марки ФБС. Ограничения вызваны следующими моментами:

Возводя опорно-столбчатый фундамент, работы можно выполнять своими руками

склонностью грунта к горизонтальным подвижкам. На таких почвах столбчатые основания подвержены боковому сдвигу;
повышенной массой здания, строительство которого планируется на почвах с пониженной несущей способностью. Столбчатый фундамент не способен выдержать вес массивных стен.

Значительные высотные перепады также создают сложности при сооружении основания столбчатого типа.

Блоки 20х20х40 – сфера применения

Популярные в строительной отрасли фундаментные блоки 20х20х40 см представляют собой изделия в форме прямоугольного параллелепипеда.

Сравнительно небольшие габариты при достаточно малом весе позволяют ускоренными темпами выполнять различные виды строительных задач:

сооружение фундаментных оснований столбчатой конструкции;
строительство оснований ленточного типа;
возведение капитальных стен объектов жилого и производственного назначения.

Небольшая масса блоков и удобные размеры позволяют оперативно осуществлять строительные мероприятия как силами профессиональных каменщиков, так и частными застройщиками.

Фундаментные блоки (размеры 20х20х40) – рекомендации по выбору

Планируя возвести фундамент из блоков 20х20х40 своими руками, необходимо ответственно подойти к выбору строительного материала. Стоит обратить внимание на изделия марки ФБС, технологический процесс производства которых регламентирован требованиям действующих стандартов.

Возможность выбора недорогого и качественного материала

Выбирая блочную продукцию, обратите внимание на следующие моменты:

максимальную несущую способность блоков, опоры из которых будут подвергаться воздействию нагрузок от массы строения;
результаты предварительно выполненных расчетов, учитывающих особенности почвы и вес возводимого здания;
рабочие характеристики блочных изделий, гарантирующие морозостойкость блоков, а также их теплоизоляционные характеристики;
использование при производстве блочной продукции различных видов заполнителя, характеристики которых влияют на запас прочности изделий.

При выборе блоков также проверьте наличие сертификатов и паспортов качества, гарантирующих соответствие блоков требованиям действующих нормативных документов.

Фундаментные блоки для строительства дома – характеристики и особенности

Приняв решение возвести фундамент из блоков 20х20х40 см, тщательно изучите характеристики материала, а также проанализируйте его достоинства и недостатки.

Остановимся на рабочих характеристиках блочного стройматериала:

длина составляет 400 мм;
ширина равна 200 мм;
высота не превышает 200 мм;
масса одного блока находится в интервале 38-34 кг;
удельный вес составляет 1,65-2,2 т/м3;
коэффициент теплопроводности не превышает 1,16 Вт/мК;
морозостойкость составляет 50 циклов и обозначается индексом F50.

Технология позволяет быстро построить опорно-столбчатую основу из блоков своими руками одному человеку

Следует обратить внимание, что предлагаемые изготовителями фундаментные блоки размером 20х20х40 см в соответствии с требованиями государственного стандарта имеют на самом деле несколько другие размеры – 390х190х188 мм. Для ускорения расчетных операций предприятия-производители используют округленное значение габаритов.

Наличие полостей – важная конструктивная особенность продукции, выпускаемой в различных исполнениях:

монолитные блоки применяются для фундаментных основ, а также строительства цокольных помещений и подвалов;
пустотелые изделия востребованы для сооружения межкомнатных перегородок, строительства перемычек и возведения стен.

Блочные изделия обладают рядом достоинств:

отсутствует необходимость использования специального строительного оборудования для подъема блоков;
нет потребности в привлечении значительного объема рабочей силы для сооружения фундамента;
не нужно собирать опалубку, возводя ленточное основание или сооружая столбчатую основу;
ускоренными темпами кладки, благодаря которым сокращается продолжительность строительного цикла;
возможностью применения для строительства в любой период года, независимо от температурных и погодных условий;
приемлемой нагрузочной способностью, позволяющей воспринимать массу строения и реакцию почвы;
доступной ценой, позволяющей значительно снизить суммарную стоимость строительных операций.

Работа начинается с правильного расчёта необходимых стройматериалов согласно предварительно подготовленному плану каркасного дома или другой постройки на ФБС

К незначительным недостаткам относятся:

увеличенный расход цементной смеси, применяемой для кладки фундамента;
необходимость дополнительного утепления, связанная с пониженными теплоизоляционными характеристиками;
восприимчивость материала к воздействию влаги, требующая надежной гидроизоляции.

Технические характеристики и эксплуатационные свойства блоков 20х20х40 позволяют использовать их для сооружения фундаментных оснований малоэтажных строений, а также для постройки подвальных помещений.

Технология возведения и важные моменты при сооружении фундаментной основы

При сооружении фундамента столбчатого типа важно учесть следующие нюансы:

выдержать расстояние между блочными опорами, составляющее от 1,3 до 3 м;
обеспечить расстояние от уровня почвы до верхней плоскости опоры 0,3-0,6 м;
выдержать толщину демпфирующей песчано-гравийной подсыпки на уровне 15-20 см;
заполнить пространство между опорами и почвой песком и щебнем.
рассчитать нагрузочную способность базы, гарантирующую устойчивость строения.

Технология, в соответствии с которой возводится столбчатый фундамент или сооружается ленточный фундамент из блоков 20х20х40, предусматривает следующие этапы:

Для предотвращения механических повреждений и перекоса конструкции на столбы нельзя устанавливать кирпичи или блоки несущих стен

Выполнение необходимых расчетов.
Определение потребности в стройматериалах.
Подготовительные мероприятия.
Разметку строительной площадки.
Извлечение грунта.
Засыпку подушки.
Кладку блоков.
Гидроизоляционные работы.

Остановимся на особенностях выполнения отдельных этапов.

Планируем сделать фундамент из блоков – подготовительные мероприятия

На подготовительной стадии выполняются следующие работы:

Определение характера грунта, уровня промерзания почвы и глубины расположения водоносных слоев.
Очистка строительной площадки от мусора и растительности с дальнейшим удалением плодородного грунта.
Планирование поверхности и разметка контура фундамента.

После завершения подготовки приступайте к земляным работам.

Готовим приямки под столбы из блоков

Извлечение грунта под фундамент осуществляется вручную или с помощью малогабаритной строительной техники. При извлечении почвы важно выдержать вертикальность стенок и углубиться в грунт, превышая уровень промерзания почвы на 0,5 м. Основание приямка следует разровнять.

По правилам строительства столбы из блоков должны устанавливаться в углах по периметру дома и под пересечением внутренних перегородок

Установка столбчатых опор

Монтаж блоков выполняется по следующему алгоритму:

Насыпьте подушку из песка и щебня.
Увлажните и утрамбуйте подсыпку.
Производите кладку блоков на цементный раствор.
Контролируйте правильность кладки.
Затрите стыковые швы.

Возводите опоры до заданной высоты над нулевой отметкой.

Выполнение гидроизоляции

Для гидроизоляционной защиты используются следующие методы:

обмазка поверхности фундамента битумным составом;
защита стенок основания листовым рубероидом.

Важно укладывать рубероид с перекрытием в 15-20 см, а при нанесении обмазочных составов осуществлять двухслойную обработку. Защитная гидроизоляция предотвратит доступ влаги и не позволит грунтовым водам размыть цементный раствор. После того, как закончен фундаментный монтаж, необходима отмостка. Она также защищает фундамент от отрицательного воздействия влаги.

Заключение

Фундамент из блоков 20х20х40 – проверенная временем конструкция, обеспечивающая устойчивость и длительный ресурс эксплуатации малоэтажных строений. Важно использовать для сооружения фундамента качественные материалы и тщательно изучить технологию. Самостоятельное выполнение работ позволит уменьшить объем затрат.

На сайте: Автор и редактор статей на сайте pobetony.ru
Образование и опыт работы: Высшее техническое образование. Опыт работы на различных производствах и стройках — 12 лет, из них 8 лет — за рубежом.
Другие умения и навыки: Имеет 4-ю группу допуска по электробезопасности. Выполнение расчетов с использованием больших массивов данных.
Текущая занятость: Последние 4 года выступает в роли независимого консультанта в ряде строительных компаний.

Фундамент из блоков фбс — как укладывать блоки технология

Как укладывать блоки, чтобы фундамент никаким образом не деформировался и крепко держал на себе всю тяжесть конструкции, зависит от того, на какой грунт укладывается блок, а также какие конкретно блоки используются.

Использование блоков для строительства фундамента актуально для тех случаев, когда нужно в кратчайшие сроки возвести здание. Как показывает практика, идеальным вариантом для возведения здания любой сложности на любых грунтах является ленточный монолитный фундамент. Но, во время монтажа такого вида основания для зданий производятся сложные технологические процессы, требующие довольно разнообразного инструмента, материалов и большого количества не только сотрудников строительной бригады, но и времени для обретения таким фундаментом нужной крепости.

Преимущества блочного фундамента

Бетонные блоки имеют большую популярность в отличие от монолитной ленточной конструкции. Блочный фундамент пригоден для грунтов с различной степенью усадки. Если это плотные песчаные грунты, то волноваться о трещинах и разрывах не приходится, так как огромные бетонные глыбы будут крепко стоять на земле. Если возводить здание на блочной основе в районах с грунтами, которые имеют высокую степень усадки, то также не нужно паниковать по поводу крепости основания возводимого здания, так как блоки будут изменять свое положение в пространстве лишь в рамках швов относительно друг друга.

Поэтому, строительство фундамента из блоков ФБС дает возможность забыть о проседании цоколя, разрывах стен и фундамента, усадке и перекосе здания. Кроме того, бетонные блоки обладают высокой морозостойкостью устойчивостью к химическим воздействиям и производятся в большом разнообразии касательно их размеров.

Вернуться к содержанию

Виды бетонных блоков

В зависимости от функционального назначения блоки из бетона подразделяются на два вида:

подушечные — имеют более высокую устойчивость, благодаря особенностям своей конструкции, которая заключается в наличии широкого нижнего края элемента. Такой блок, выполненный в форме трапеции, крепко держит на себе вес всего надземного сооружения;
стеновые — представляют собой ровные геометрические элементы с ребром в виде прямоугольника, что значительно экономит трудовые и материальные затраты во время строительно-монтажных работ.

В зависимости от наличия технологических отверстий блоки могут разделяться на:

ФБС — это цельные монолитные бетонные элементы, не имеющие никаких отверстий и пустот;
ФБВ-блоки имеют специальные отверстия и прорези для удобства прокладки коммуникаций;
ФБП — это универсальные пустотелые бетонные блоки П-образной формы.

Вернуться к содержанию

Виды фундаментов с применением блоков

Столбчатый фундамент

Этот вид основания похож по своей конструкции на свайный тип фундамента. Особенности такого фундамента заключается в том, что по периметру всего здания, а также внутри в местах прохождения несущих стен устанавливаются блочные столбчатые конструкции. Размеры таких бетонных опор обычно варьируются в пределах 40х40 см. Технологически на практике это выглядит так:

копается яма нужной глубины в зависимости от требуемой прочности фундамента;
утрамбовывается дно каждой ямы с целью предотвращения усадки;
укладывается слой песка толщиной в 5 см и щебня толщиной в 10 см;
на тщательно подготовленное основание укладываются блоки, образуя столбчатые опоры необходимой высоты.

Во избежание будущего перекоса здания необходимо использовать лазерный уровень или попросту натянуть веревку между двумя крайними столбами.

Столбчатые фундаменты, очень часто используются для возведения конструкций незначительного веса: щитовые дома, цветочные павильоны, торговые контейнеры и различные легкие деревянные сооружения.

Вернуться к содержанию

Ленточный фундамент из блоков ФБС

Конструкции основания такого типа используются для возведения зданий значительных весов и размеров: от частных домов и особняков до многоэтажных небоскребов. В зависимости от несущей нагрузки используются блоки разных размеров. В большинстве случаев применяются блоки стандартных размеров:

300х780х580 мм;
400х1180х580 мм;
600х2380х580 мм.

Этапы устройства ленточного фундамента разделены на следующие шаги:

выкапывание траншеи или котлована для будущего здания;
трамбовка основания ямы;
засыпка слоя песка и щебня;
установка опалубки;
монтаж армирующего слоя;
заливка бетона;
демонтаж опалубки и установка гидроизоляции;
укладка блоков необходимого размера по периметру ленточного основания.

Именно заливка чернового подготовительного основания для фундамента является важнейшим моментом, пренебречь которым нельзя. Черновое железобетонное основание не позволяет тяжелым блокам ФБС проседать или смещаться в сторону каким-либо образом, что обеспечивает в дальнейшем целостность и долговечность надземной конструкции.

Вернуться к содержанию

Особенности выполнения работ при монтаже фундамента

Чтобы будущее здание стояло ровно, долго и имело достойный вид, необходимо соблюдать все технологические требования по выполнению работ. Первым вопросом, который должен задать себе любой строитель, взявшийся за устройство фундамента из блоков, будет касаться вида грунта, на котором будет находиться строение.

Конструкции такого типа возводятся преимущественно на грунтах с высоким содержанием песка, низким уровнем залегания подземных вод и в регионах с благоприятными погодными условиями.

Вторым важным моментом будет правильное нанесение разметки на местности, а также рациональное распределение ресурсов использования пространства. При небрежном отношении прораба к своим должностным обязанностям падает скорость выполнения работы и ее качество.

Во время монтажа опалубки необходимо определить, сколько для этого понадобится леса.

Скрепить все доски нужно таким образом, чтобы они не отклонялись в сторону, не деформировались и не искривляли в будущем черновое основания фундамента. После заливки жидкого бетона следует выдержать все необходимые сроки согласно строительным нормам, иначе качество основания может быть низким, что в будущем приведет к нестабильности конструкции.

Сборный фундамент из блоков ФБС может устанавливаться с сочетанием кирпича или камня. Такая практика применяется при монтаже блоков больших размеров, что способствует более точному выставлению ФБС-элементов по уровню и препятствует образованию различных трещин и разрывов.

Укладка бетонных блоков производится на цементный раствор, швы заполняются промежуточными материалами вперемешку с раствором на цементной основе. Зазоры в виде заполненных швов позволяют дышать всей конструкции, сохраняя свою первоначальную устойчивость.

После установки фундаментных блоков производится обязательное армирование верхнего слоя конструкции. Эта обвязка может выполняться, как при помощи монолитного метода, так и с применением кирпича.

Отмостка устанавливается на уровне армирующего пояса и предназначается для защиты фундамента от попадания влаги, которая может негативно повлиять на устойчивость всей конструкции. На армирующий пояс укладывается слой гидроизоляции, который при желании можно запустить даже под отмостку.

И всё-таки, несмотря на сложность и трудоемкость строительно-монтажных работ, одним из наиболее устойчивых оснований является фундамент из блоков ФБС. Как укладывать блоки, можно рассмотреть схематически.

Фундамент столбчатого типа выполняется в такой же последовательности, отличительной частью при этом будет являться всего лишь внешний вид конструкции.

Если заказчик все же решился монтировать фундамент из блоков ФБС, пошаговая инструкция всего строительного процесса будет выглядеть следующим образом:

исследование грунта;
нанесение разметки;
выкапывание траншеи или котлована;

трамбовка земельного основания;
засыпка песка или щебня и еще одна трамбовка;
монтаж ленточного железобетонного основания или фундаментных плит;
установка армирующего пояса;
монтаж фундаментных блоков;
установка слоя обвязки;
укладка гидроизоляции и монтаж отмостки;
возведение стены цоколя.

Что касается самостоятельного выполнения работ, то монтировать фундамент из блоков ФБС своими руками не рекомендуется в большинстве случаев, так как это довольно трудоемкий и технологически сложный процесс.

Во-первых, необходимо выполнить все расчеты, которые будут заключаться в выборе того или иного вида материалов. При этом нужно учитывать не только особенности грунтов, погодные условия, но и вычислить и сопоставить соотношения нагрузки надземной части строения с крайне допустимым сопротивлением конкретно используемых фундаментных плит и блоков.

Во-вторых, во время выполнения строительно-монтажных работ понадобится тяжелая строительная техника вместе с бригадой квалифицированных рабочих, которые быстро, ровно и качественно установят тяжелые железобетонные блоки ФБС.

Самостоятельно соорудить подобный фундамент возможно лишь в случае строительство легких надземных конструкций, которые не требуют блоков больших весов и размеров. В этом случае целесообразнее всего строить фундамент столбчатого типа с применением блоков ФБС.

Несмотря на то, какой вид основания будет установлен под тем или иным строением, выполнение всех технологических норм и инструкций гарантирует качество и долговечность фундамента, а вместе с ним надежность и безопасность всего здания.

Не нашли ответов в статье? Больше информации по теме:

Фундамент из блоков ФБС, Фундамент из блоков ФБС пошагавая инструкция

Фундамент из блоков ФБС имеет несколько преимуществ, которых нет ни у одного типа фундаментов.ФБС (фундаментный блок стеновой) и ФБП (фундаментный блок пустотный) изготавливают из легкого, силикатного и тяжелого бетона, керамзитобетона. Блоки ФБС могут иметь армокаркас, или иметь только монтажные петли. Торцы блоков имеют технологические пазы, в которые закладывают цементный раствор при монтаже. Рассмотрим подробно устройство фундамента из блоков ФБС.

Важным моментом является то, что блоки выпускают унифицированных размеров, количество типоразмеров достаточно для формирования практически любой конструкции ленточного и столбчатого фундамента, а также их вариантов. Ширина блоков выбирается под толщину стен здания.

Плюсы и минусы фундамента из блоков ФБС

Применение фундамента из блоков ФБС имеет свои преимущества и недостатки. Для понимания объективной картины рассмотрим их подробно.

Плюсы фундамента на основе блоков ФБС

Преимущества выбора и устройства фундамента из блоков ФБС состоят в следующем:

скорость возведения и простота устройства, не требующая специальных навыков
можно вести работы независимо от температуры воздуха и погодных условий, и в дождь, и в снегопад
структура готовой конструкции не абсолютно жесткая, а имеет некоторую гибкость и подвижность за счет стыков. Жесткий ленточный монолит под воздействием сил морозного пучения подвержен большим нагрузкам, чем гибкий блочный.

Минусы фундамента на основе блоков ФБС

Но и о недостатках забывать стоит, перечислим их:

для монтажа необходима специальная грузоподъемная техника
наличие стыков, ослабляющих конструкцию, требует серьезной гидроизоляции
несмотря на высокую несущую способность неприменим на глинистых и пучинистых грунтах, а также на просадочных и недостаточно плотных

Пошаговая инструкция устройства фундамента из блоков ФБС

Последовательность монтажа фундамента на основе блоков ФБС:

первыми устанавливают блоки- маяки, определяющие углы и участки пересечений несущих стен
между блоками-маяками кладут первый ряд блоков, заполняя вертикальные швы цементным раствором на толщину 20 мм. При необходимости используют доборные элементы, не забывая оставлять проектные отверстия под коммуникации. Края отверстий укрепляются, или вставляются гильзы, после прокладки труб зазоры заполняются бетоном.
второй ряд блоков монтируют с перевязкой, по типу кладки из кирпича. Но с той разницей, что отступы от краев блоков первого ряда принимают не из соображений эстетики, и исходя из прочности грунтов основания. Если внизу пучинистая глина, то вертикальные швы перевязки делают посередине блока нижнего ряда. В случае, если основание прочное, отступ от края делают на 0,4 — 0,5 высоты монтируемого блока.

после того, как смонтирован верхний ряд блоков, заливают армопояс. Армирование выполняется тремя рядами стержней или сеткой. Армопояс выравнивает верх фундамента под стены и повышает надежность конструкции.
горизонтальные и вертикальные стыки между блоками заполняются раствором на всю глубину, пустошовки быть не должно. Расшивка междублочных швов производится и снаружи, и изнутри.
небольшие участки можно перекрывать не только доборными блоками, но и кладкой из кирпичей или замоноличивать.

Если на участке имеется высокий уровень грунтовых вод, выше основания фундамента, то все стенки гидроизолируют оклеечной или обмазочной изоляцией, и как более надежный вариант – жидкой резиной.

Обратная засыпка траншей и котлованов с применением речного или карьерного песка производиться слоями, с уплотнением каждого слоя трамбовкой.

Презентация антигена эпителиальными клетками легких направляет функцию клеток CD4 + TRM и регулирует барьерный иммунитет

Идентификация SPC

^низкий MHC ^{высокий} LEC

Мы стремились идентифицировать LEC с антигенпредставляющими способностями во время гомеостаза. Поскольку MHC-II локализован в клетках AT2 ¹⁴, а клетки AT2 не имеют известных клеточно-специфических поверхностных маркеров, полезных для проточной цитометрии, мы использовали мышей, экспрессирующих GFP под контролем промотора человеческого сурфактантного протеина C (SPC) (мыши SPC-GFP). ) ²⁰ для различения ячеек SPC-GFP ^high AT2.На исходном уровне LEC из легких, переваренных эластазой (рис. 1a), разделены на два кластера на основе профилей MHC-II. Кластер MHC-II ^low в основном состоял из LEC дыхательных путей (т.е. клубов и мультицилитированных клеток) с минимальным вкладом клеток альвеолярного типа 1 (AT1) (Рис. 1a и Дополнительный Рис. 1a ) . Кластер MHC-II ^high состоял из ячеек SPC-GFP ^high AT2 и фракции сопоставимого размера ячеек SPC-GFP ^low (рис.1a и дополнительный рис.1а ) . Интересно, что клетки SPC-GFP ^low экспрессировали больше MHC-II, чем клетки AT2, что почти сопоставимо с уровнями, наблюдаемыми на профессиональных APC CD45 ⁺ CD24 ⁺ MHC-II ⁺ (рис. 1b и дополнительный рис. 1b). ). Эти клетки SPC-GFP ^low показали меньший разброс вперед, сравнимый с клубными клетками (фиг. 1c), и более высокий интегрин β4 (фиг. 1d) и антиген стволовых клеток Sca-1 (фиг. 1e) по сравнению с клетками AT2. Мы стремились определить клетки SPC-GFP ^low, используя мРНК для маркеров, определяющих клон.Клетки SPC-GFP ^low коэкспрессировали маркеры, характерные для клеток AT2 ( Spc ) и клубных клеток ( Scgb1a1 ), но не маркеры для мультицилиндрических клеток ( Foxj1 ) или клеток AT1 ( Aqp5 ) (рис. 1е). Чтобы дополнительно охарактеризовать этот тип LEC, мы использовали мышей-репортеров бронхоальвеолярных стволовых клеток (BASC), которые экспрессируют YFP и mCherry, вставленные в локусы Spc и Scgb1a1 , соответственно ²¹ ( Fig. 1g ) .Эти мыши подтвердили популяцию клеток SPC ^low с высокими уровнями MHC-II и показали, что они отличимы от клубных клеток (SCGB1A1 ^high), которые были MHC-II ^low, бронхоальвеолярными стволовыми клетками ²² ( BASC; SCGB1A1 ^medium SPC ^medium), которые были MHC-II ^medium, и клетки AT2 (SPC ^high), которые были MHC-II ^high ( Fig. 1g ) . Клетки SPC-YFP ⁺ постоянно обнаруживались в альвеолах, а не в проводящих дыхательных путях, что указывает на альвеолярное расположение LEC SPC ^low (рис.1ч). Просвечивающая электронная микроскопия (TEM) отсортированных LEC SPC ^low показала, что эти клетки содержат как пластинчатые тела, определяющие клетки AT2, так и электронно-плотные секреторные пузырьки, характерные для клубных клеток ( Fig. 1i ) . Пластинчатые тельца наблюдались исключительно в альвеолах и никогда в дыхательных путях при осмотре> 100 анатомически различных областей легких мышей C57BL / 6J (дополнительный рис. 1c), что привело нас к выводу, что SPC ^low MHC-II ^high клетки локализуются в альвеолы, а не проводящие дыхательные пути.Клетки SPC ^low также обладали профилем транскриптов, включая Sox2, молекулу MHC-I h3-K1 , длинную некодирующую РНК Aw112010 и регулятор клеточного цикла Cdkn1a (дополнительный рис. 1d ) , напоминает дистальные стволовые клетки легких ²³. Таким образом, эти данные предполагают дискретный набор LEC SPC ^low, которые экспрессируют высокие количества MHC-I и MHC-II, демонстрируют особенности транскрипции клеток-предшественников легких, а также поверхностные маркеры, транскрипционные и структурные характеристики, отличные от обычных типов LEC. в дальнейшем именуемые SPC ^low MHC ^high LEC.

Рис. 1. Помимо клеток AT2, MHC-II высоко экспрессируется SPC ^low MHC ^high LEC.

a Генетическая конструкция мышей SPC-GFP и стратегия стробирования для идентификации основных LEC, включая булаву ( желтый, ), мультицилиатную ( красный ), альвеолярный тип 1 (AT1, фиолетовый ), SPC ^низкий ( синий ), эпителиальные клетки легких альвеолярного типа (AT2, зеленый ) у мышей SPC-GFP. b Контурная диаграмма и количественное определение LEC MHC-II.CD45 ⁺ CD24 ⁺ MHC-II ⁺ БТР, выделенные темно-синим цветом . Односторонний дисперсионный анализ с множественным сравнительным тестом Холма-Сидака. c Гистограмма и количественное определение размеров ячеек LEC, односторонний дисперсионный анализ с тестом множественного сравнения Холма-Сидака. Гистограмма и количественная оценка для d эпителиального маркера дыхательных путей β4 интегрина и e антигена стволовых клеток, Sca-1 с помощью SPC-GFP ^low и клеток AT2, двусторонний тест Манна-Уитни. f Уровни мРНК отобранных клон-определяющих транскриптов в отсортированных LEC, двусторонний тест Манна-Уитни.Стратегия сортировки такая же, как и стратегия стробирования на рис. 1a. г Контурный график для идентификации отдельных LEC у мышей-репортеров бронхоальвеолярных стволовых клеток (BASC) и количественной оценки LEC MHC-II, однофакторный дисперсионный анализ ANOVA с тестом множественного сравнения Тьюки. Показаны основные LEC, включая булаву (, желтый, ), BASC (, пурпурный, ), SPC ^{, низкий} (, синий, ), альвеолярный тип (AT2, , зеленый, ) и другие клетки (серый). ч Репрезентативная иммунофлуоресцентная микрофотография, показывающая анатомическое расположение клеток SPC-YFP ⁺ ( зеленый ) и SCGB1A1-mCherry ⁺ ( красный ) с DAPI ( синий ), используемым в качестве контрастного красителя.Данные представляют n = 2 мыши, 2 эксперимента. i Типичные электронные микрофотографии трансмиссии для LEC, отсортированных и объединенных от n = 3 мышей SPC-GFP. Эксперимент повторяли дважды. Желтые звездочки обозначают электронно-плотные секреторные пузырьки, а зеленые звездочки обозначают пластинчатые тела. Все данные имеют n, ≥ 5 мышей, два независимых эксперимента. Все данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего.

LEC демонстрируют анатомически сегрегированные и динамические во времени активности APC

Чтобы установить, является ли презентация антигена особенностью LEC, мы исследовали их способность к поглощению и переработке антигена путем интратрахеальной инстилляции DQ-овальбумина (DQ-OVA).В соответствии с захватом антигена и протеолитической деградацией DQ-OVA с высвобождением гашеного флуорофора, мы наблюдали флуоресценцию во всех LEC на исходном уровне и после инфицирования Spn серотипа 19F (рис. 2а и дополнительный рис. 1а). Поскольку способность к процессингу антигена наблюдалась в клетках с очень низким значением MHC-II на исходном уровне, мы проверили, изменились ли уровни MHC-II в условиях инфекции, когда презентация антигена становится необходимой. Действительно, инфекция Sp19F увеличивала MHC-II на ^{LEC-II с низким уровнем MHC-II, в то же время усиливая его экспрессию на дистальных LEC, которые всегда оставались самыми высокими экспрессорами MHC-II (рис.2б). Кроме того, поддерживая функции APC, все LEC, отсортированные из инфицированных легких, демонстрировали клеточно-специфические паттерны вспомогательных генов, связанных с MHC-II (дополнительный рис. 2a), и активировали антиген-специфические CD4 ⁺ Т-клетки в MHC-II-зависимой моде in ex vivo co. -культуры ( Дополнительный рис. 2b ) . Наконец, чтобы явно установить LEC как APC, мы создали мышей, лишенных MHC-II в LEC, путем скрещивания мышей h3-Ab ^{fl / fl} ²⁴ с Nkx2.1 ^Cre-ERT2 мышей ²⁵ (далее MHC-II ^ΔEpi) (рис.2c ) . Введение тамоксифена эффективно удаляло весь исходный или индуцированный MHC-II на LEC (дополнительный рисунок 2c, d), оставляя MHC-II нетронутым на других типах клеток (дополнительный рисунок 2e). Стимуляция антиген-специфических CD4 ⁺ Т-клеток LEC, питающимися антигеном, была нарушена нацеливанием гена MHC-II (фиг. 2c). Таким образом, наши результаты показывают, что все LEC реагируют на инфекцию увеличением MHC-II на своей поверхности, а LEC MHC-II опосредует презентацию антигена Т-клеткам CD4 ⁺.}

Рис. 2: LEC отображают анатомически сегрегированную и динамически динамическую активность APC.

a Гистограмма и количественная оценка способности поглощения и обработки LEC in vivo DQ-овальбумина (DQ-OVA) LEC от наивных и Sp19F-инфицированных мышей через 48 часов после инфицирования (hpi), двусторонний тест Манна-Уитни. b Гистограмма и количественное определение LEC MHC-II от наивных и инфицированных Sp19F мышей 48hpi, двусторонний тест Манна – Уитни. c Генетическая конструкция и экспериментальный график мышей MHC-II ^ΔEpi.Количественная оценка активации OT-II CD4 ⁺ Т-клеток с помощью MHC-II ^{fl / fl} и MHC-II ^ΔEpi LEC, отсортированных от Sp19F-инфицированных мышей через 48 часов после инфицирования (hpi), односторонний Непарный тест t . Стратегия сортировки на дополнительном рисунке. 2c. Обратите внимание, разные шкалы для оси Y на рис. 2a – c подчеркивают, что все LECs способны к презентации антигена, хотя и с разными амплитудами, в зависимости от их анатомического положения. d Схема экспериментальной временной шкалы. и opt-SNE график, изображающий 6 метакластеров LEC, идентифицированных из ~ 2 миллионов LEC, выделенных из n = 84 мышей в девяти временных точках, каждая из которых была проведена в двух независимых экспериментах. f Изображение тепловой карты для экспрессии молекул, связанных с APC, нанесенных на проекцию opt-SNE. Временное количественное определение для г, MHC-II, ч, CD40, и . CD86, j ICAM1, k PD-L1 и l PD-L2 в разных LEC. Двусторонний дисперсионный анализ с LSD-тестом Фишера. Статистика для рис. 2g – l представлена в дополнительной таблице 1-6. Все данные имеют n, ≥ 4 мышей, два независимых эксперимента. Все данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего.

Презентация антигена модулируется костимулирующими сигналами, поэтому мы исследовали, выражались ли такие сигналы какими LEC и когда. Повторное воздействие Spn индуцирует образование защитных CD4 легких ⁺ T _RM клеток ¹⁹. Мы собрали LEC из нескольких временных точек после заражения Spn (рис. 2d) и подвергли их 17-параметрической многомерной мультиспектральной проточной цитометрии (MSFC) панель, которая включала антитела к MHC-II, костимулирующим молекулам (CD80, CD86). , CD40, ICOS-L), молекулы клеточной адгезии с костимулирующими функциями (ICAM1 и VCAM1) и коингибиторные молекулы (PD-L1 и PD-L2).Приблизительно 2 миллиона CD45 ^— EpCAM ⁺ LEC от 84 мышей C57BL / 6J в разные моменты времени были объединены, спроецированы в двумерное оптимизированное t-распределенное стохастическое встраивание соседей (opt-SNE) пространство ²⁶ и подверглись неконтролируемой кластеризации с использованием Алгоритм фенографа ²⁷. Это дало нам возможность (i) идентифицировать отдельные кластеры LEC на основе профилей экспрессии, объединяющих все измерения, а не отдельные поверхностные маркеры, и (ii) количественно определять относительную численность этих кластеров с течением времени.Кластеризация фенографа идентифицировала 34 различных кластера LEC, которые агрегированы в 6 метакластеров, соответствующих каждому типу LEC (рис. 2e и дополнительный рис. 3a, b). Один метакластер не полностью соответствовал распознанным типам LEC и общим клубным и многоцелевым признакам, вероятно, представляющим переходное состояние от булавы к многоцелевым (кластеры 14, 18, 19), что согласуется с нашей временной шкалой, охватывающей повреждение эпителия легких и регенерацию ²⁸. Визуализация Opt-SNE подтвердила идентичность этих метакластеров (дополнительный рис.3в) ²⁶. Как и ожидалось, некоторые кластеры были продуктами динамических сигнальных событий, и не все кластеры присутствовали одновременно; вместо этого внутри каждого метакластера определенные кластеры доминировали в определенные моменты времени (дополнительный рис. 3d). Эти наблюдения демонстрируют, что LEC подвергаются динамической модуляции фенотипов поверхностных APC во время микробных инфекций, одновременно с образованием ниш CD4 ⁺ T _RM легких.

Затем мы проследили уровни поверхностной экспрессии молекул, направленных на Т-клетки, на метакластерах LEC ( рис.2e ) и обнаружили, что экспрессия костимулирующих / коингибиторных молекул на LECs была динамичной и высокоспецифичной для клеточного типа (Fig. 2f-l and Supplementary Table 1-6 ) . Клетки клуба и мультицилифицированные клетки постоянно экспрессировали более высокие уровни костимулирующих Т-клеток CD40 ( фиг. 2f, h ) и CD86 ( фиг. 2f, i ) , соответственно, по сравнению с любыми другими LEC. SPC ^low MHC ^high LEC экспрессировали самые высокие уровни коингибиторной молекулы Т-лимфоцитов PD-L1, за которыми следовали клетки AT2, а затем все остальные LEC (рис.2е, к). Мультицилифицированные клетки были высокими экспрессорами PD-L2 ( фиг. 2f, l ) . ICAM1 был повышен на всех LEC во время активного воспаления, но особенно на клетках AT2 (рис. 2j). На протяжении всего времени практически не наблюдалось CD80, ICOS-L или VCAM1 на любом LEC (дополнительный рис. 3c). Модуляция молекул APC на LEC на 8 день была вызвана микробами, так как отсутствие инфекции не провоцировало такие изменения ( Supplementary Fig. 4 ) . Эти данные показывают, что все LEC экспрессируют костимулирующие молекулы клеточно-специфическим образом.Столбчатые LEC проводящих дыхательных путей (включая булаву и мультицилиатные клетки) имеют индуцибельную MHC-II и конститутивную экспрессию костимуляторов (CD40 и CD86, соответственно), тогда как LEC, содержащие пластинчатые тела, альвеолярные LEC (клетки AT2 и SPC ^низкий MHC ^{высокий} LEC) экспрессируют конститутивный MHC-II с PD-L1 (оба из которых увеличиваются во время инфекции).

Презентация антигена LEC способствует CD4

⁺ T _RM клеточные ниши вокруг проводящих дыхательных путей

Мы предположили, что анатомически сегрегированный паттерн презентации антигена LEC определяет образование CD4 ⁺ T _RM ниш в бронхо-сосудистых пучках. авиалинии ²⁹.Чтобы проверить это, мы сначала отслеживали временную динамику CD4 ⁺ Т-клеток в моменты времени, совпадающие с презентацией антигена LEC, с использованием проточной цитометрии (как на рис. 2d ) . Чтобы точно отличить циркулирующие Т-клетки CD4 ⁺ от CD4 ⁺ в легких, мы использовали метод маркировки антител in vivo ³⁰ и создали комплексные снимки динамики набора, расширения и сокращения Т-лимфоцитов CD4 ⁺, приводящих к образованию CD4 ⁺ T _RM ниши (рис.3a и дополнительный рис. 5a ) . Одна инфекция Sp19F спровоцировала умеренное, но временное увеличение количества CD4 ⁺ Т-клеток к 3-му дню (рис. 3a). Мы не знаем антигенную специфичность этих Т-клеток, но в такой ранний момент времени мы подозреваем, что они, скорее всего, не были специфичными для Spn , а представляли собой смесь наивных и неродственных клеток, которые были задействованы в легких из-за воспаление. В соответствии с этим единичная инфекция Sp19F не индуцирует CD4 ⁺ T _RM в легких (дополнительный рис.5б). Вторая инфекция Sp19F на 7 день; тем не менее, вызывало быстрое привлечение всех обычных подмножеств Т-лимфоцитов CD4 ⁺, включая наивный T (T _Naive), центральную память T (T _CM), эффекторную память T (T _EM) и эффекторную T (T _eff) клеток (рис. 3a и дополнительный рис. 5c). Количество CD4 ⁺ Т-клеток достигло пика к 10-му дню, при этом доминирующие подмножества включали клетки CD4 ⁺ T _Naive, T _CM и T _EM, а также активированные и расширяющиеся клетки T _eff.В этот момент ~ 17% клеток легкого CD4 ⁺ T _eff экспрессировали IL-2Rα (CD25), что свидетельствует о зависимости от передачи сигналов IL-2. Между 10 и 24 днями компартмент CD4 ⁺ Т-клеток легких сокращался до тех пор, пока не осталось клеток CD4 ⁺ T _RM и небольшого пула патрулирующих клеток CD4 ⁺ T _EM. CD4 ⁺ T _eff клетки были самыми высокими экспрессирующими PD-1, с наибольшим поверхностным PD-1 на 10 день (рис. 3b, c). Интересно, что экспрессия LEC PD-L1 увеличилась на 8-й день (рис.2k) перед пиком CD4 ⁺ T _eff PD-1 (рис. 3c). Следует отметить, что только клетки CD4 ⁺ T _RM были PD-1 ^{на высоком уровне} в покоящихся, но испытанных легких на 35-й день (фиг. 3d).

Рис. 3: LEC MHC-II облегчает засев ниш CD4 ⁺ T _RM вокруг проводящих дыхательных путей.

a Количество легких (ivCD45.2 ^—) CD4 ⁺ субпопуляций Т-клеток в назначенные моменты времени, n ≥ 5 мышей / момент времени, два независимых эксперимента, за исключением дня 10 ( n = 3 мышей). b Гистограмма для PD-1 на CD4 ⁺ Т-клеток на 10-й день. c Уровни PD-1 на CD4 ⁺ Т-клеток в назначенные моменты времени, Двусторонний дисперсионный анализ с двухэтапным повышающим методом анализа. Бенджамини, Кригера и Йекутиели для исправления множественных сравнений. Значение FDR q : * ≤0,05 сравнений с T _EM, ^# ≤0,05 сравнений с CD25 ⁺ T _eff клеток, n = 6 мышей / момент времени, два эксперимента, кроме дня 10 ( n = 3 мыши). d Гистограмма PD-1 на CD4 ⁺ Т-клетках на 35 день. e Репрезентативные иммунофлуоресцентные микрофотографии, показывающие анатомическое расположение клеток CD4 ⁺ ( красный ) в назначенные моменты времени. Автофлуоресценция (AF) идентифицирует структуры легких. Данные представляют n = 6 мышей / момент времени, за исключением дня 14 ( n = 5 мышей), два эксперимента. f Количественная оценка рис. 3e, двусторонний дисперсионный анализ с двухэтапным повышающим методом Бенджамини, Кригера и Йекутиели для корректировки множественных сравнений.Значение FDR q : * ≤0,05 сравнений с паренхимой, ^# ≤0,05 сравнений с дыхательными путями и ^Φ ≤0,05 сравнений с 8-м днем в нише, n = 6 мышей / момент времени, кроме 14-го дня ( n = 5 мышей), два независимых эксперимента. г Хронология экспериментов. ч Репрезентативные иммунофлуоресцентные микрофотографии ( вверху, ) и количественная оценка ( внизу ), показывающие анатомическое распределение клеток CD4 ⁺ в опытных легких MHC-II ^{fl / fl} и MHC-II ^ΔEpi на 56 день.Данные представляют n = 8 MHC-II ^{fl / fl} и n = 6 MHC-II ^ΔEpi мышей, два эксперимента. Односторонний дисперсионный анализ с двухэтапным повышающим методом Бенджамини, Кригера и Йекутиели для корректировки множественных сравнений. FDR q значение: * ≤0.05. i Хронология блокады CD40L. Количество легких (ivCD45.2 ^—) CD4 ⁺ — Т-клетки, T _RM (CD11a ^{высокий} CD69 ⁺) клеток и CD103 ⁺ T _RM клеток на 35 день в опытные мыши с MR-1 (блокада CD40L) или контроль IgG, n ≥ 5 мышей, два независимых эксперимента, односторонний дисперсионный анализ ANOVA с тестом множественного сравнения Даннета.Все данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего.

Мы использовали иммунофлуоресценцию для локализации клеток CD4 ⁺ во время создания ниш CD4 ⁺ T _RM (рис. 3e, f). Вторая инфекция Sp19F на 7 день вызвала быстрое рекрутирование клеток CD4 ⁺ на 8-10 дни в рыхлом интерстиции бронховаскулярных пучков, окружающих скоординированные деревья ветвления артерий и дыхательных путей нижних дыхательных путей (рис. 3e, f и Дополнительный рис. 5c). Разрешение инфекции между 14 и 24 днями было связано с сокращением клеток CD4 ⁺ в паренхиме и бронховаскулярных пучках, за исключением LEC дыхательных путей, где, по-видимому, была стабильная клеточная ниша CD4 ⁺ (рис.3д, е). К 35 дню, через 4 недели после заражения, все оставшиеся клетки CD4 ⁺ были клетками CD69 ⁺ T _RM в этих покоящихся легких (рис. 3a), и они локализовались исключительно вокруг проводящих дыхательных путей (рис. 3e, f). ). Эти наблюдения предполагают, что ниша дыхательных путей способствует выживанию и / или поддержанию рекрутированных CD4 ⁺ Т-клеток (возможно, через MHC-II плюс костимулирующие CD40 и / или CD86 клубных и мультицилированных клеток) с образованием CD4 ⁺ T _{Клетки RM}, в то время как паренхимные ниши вызывают сокращение CD4 ⁺ Т-клеток (возможно, через LEC MHC-II плюс коингибиторные молекулы, такие как PD-L1) во время разрешения инфекции.Если это так, делеция LEC MHC-II должна нарушить анатомическое распределение ниш CD4 ⁺ T _RM в легких.

Чтобы проверить это, мы создали ниши CD4 ⁺ T _RM в легких MHC-II ^{fl / fl} и MHC-II ^ΔEpi и систематически количественно оценили их анатомическое распределение (рис. 3g, h). Было подтверждено стойкое отсутствие MHC-II (дополнительный рис. 5d). В соответствии с представлением о том, что LEC MHC-II способствует образованию CD4 ⁺ T _RM клеточных ниш в бронховаскулярных пучках, легкие MHC-II ^ΔEpi демонстрируют более редкие CD4 ⁺ T _RM ниш вдоль эпителия дыхательных путей. в бронховаскулярном интерстиции (рис.3ч). Однако потеря LEC MHC-II не изменила количество CD4 ⁺ Т-клеток в паренхиме, что позволяет предположить участие других механизмов в их сокращении. Для проведения LEC в дыхательных путях MHC-II перекрывался с CD40 лучше, чем с CD86 (рис. 2f – i), что позволило нам проверить, зависит ли частота клеток CD4 ⁺ T _RM в легких от сигналов CD40, предлагаемых клубом. клетки в дополнение к другим каноническим клеткам CD40 ⁺. Мы исследовали это, используя антитело MR-1 для блокирования взаимодействия CD40-CD40L во время набора клеток CD4 ⁺ T _eff, специфичных для Spn (рис.3i). В соответствии с требованием для сигналов CD40 для образования / поддержания клеток CD4 ⁺ T _RM, блокада взаимодействий CD40-CD40L значительно снижает CD4 ⁺ Т-лимфоцитов в легких, CD4 ⁺ T _RM клеток и CD103 ⁺ CD4 ⁺ T _RM номера клеток (рис. 3i). Взятые вместе, наши результаты показывают, что презентация антигена с помощью LEC облегчает образование ниш CD4 ⁺ T _RM вокруг проводящих дыхательных путей, но не требует их исключения из паренхимы легких.

CD4

⁺ T _{Клетки RM} демонстрируют мультипотентные фенотипы, которые ограничиваются LEC MHC-II

Резиденция CD4 ⁺ T _RM клеток в барьерных тканях в качестве передовых адаптивных иммунных дозорных включает неизбежные и повторяющиеся стимуляции со стороны когнитивных факторов. антигены на протяжении их жизни. Затем мы спросили, влияет ли презентация антигена LEC на активность клеток CD4 ⁺ T _RM во время повторных встреч с воспоминаниями. Чтобы проверить это, мы создали клетки CD4 ⁺ T _RM в легких MHC-II ^ΔEpi и MHC-II ^{fl / fl}, как показано на рис.3g, с последующим повторяющимся воздействием несоответствующего серотипу нелетального штамма Spn серотипа 23A (Sp23A) (рис. 4a). Удаление LEC MHC-II не препятствовало реактивации клеток CD4 ⁺ T _RM и не влияло на быстрый клиренс Spn (дополнительный рис. 6a – d), и, как таковые, эти инфекции имитируют гомеостатическое несмертельное вдыхание микробов, которым подвергается легкие взрослого человека уже содержат клетки CD4 ⁺ T _RM. Измерения клеточности дыхательных путей не выявили продолжающегося воспаления, о чем свидетельствует содержание нейтрофилов <1% в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) на 105 день (дополнительный рис.6e ) . Устойчивая делеция LEC MHC-II была подтверждена (дополнительный рис. 6f).

Рис. 4: LEC MHC-II направляет активность клеток CD4 ⁺ T _RM.

a Схема экспериментальной временной шкалы и используемой панели антител. b Слева: Тепловая карта, отображающая нормализованные уровни экспрессии отдельных молекул в легких (ivCD45.2 ^–), память (CD44 ⁺ CD11a ⁺) CD4 ⁺ кластеры Т-клеток на 105 день .Показан статус фактора транскрипции, определяющего клон (LDTF) каждого кластера. Справа: Относительная численность каждого кластера на 105 день в легких MHC-II ^{fl / fl} и MHC-II ^ΔEpi. Двусторонний дисперсионный анализ с двухэтапным пошаговым методом Бенджамини, Кригера и Йекутиели для корректировки множественных сравнений. FDR p значение: * ≤ 0,05. c Слева: Тепловая карта, отображающая нормализованные уровни экспрессии различных молекул во внутрисосудистой крови (т.е.v.CD45.2 ⁺) память (CD44 ⁺ CD11a ⁺) CD4 ⁺ Т-клеточные кластеры на 105 день. Отображается состояние LDTF каждого кластера. Справа : Относительная численность каждого кластера на 105 день в легких MHC-II ^{fl / fl} и MHC-II ^ΔEpi. Двусторонний дисперсионный анализ с двухэтапным пошаговым методом Бенджамини, Кригера и Йекутиели для корректировки множественных сравнений. FDR p значение: * ≤ 0,05. d Относительные индексы мультипотентности для памяти (CD44 ⁺ CD11a ⁺) CD4 ⁺ Т-лимфоцитов в легких ( круг ) и крови ( треугольник ) MHC-II ^{fl / fl} ( белый ) и MHC-II ^ΔEpi ( красный ) на 105 день, односторонний дисперсионный анализ с тестом множественного сравнения Холма-Сидака. e Частота активированных (CD69 ⁺) Tbet ⁺, Gata3 ⁺ или RORγT одноположительных (SP) T _H 17 клеток в MHC-II ^{fl / fl} и MHC-II ^ΔEpi легких 8hpi Sp35B, двусторонний дисперсионный анализ с LSD-тестом Фишера. Для всех экспериментов положительность для LDTF определялась с использованием пороговых значений, определенных для кластеров, отрицательных для этого LDTF. f Профиль внутриклеточного окрашивания цитокинов (ICS) легкого (i.v.CD45.2 ^—) и крови (i.v.CD45.2 ⁺) CD4 ⁺ Т-клетки, выделенные из легких на 105 день и стимулированные PMA / иономицином ex vivo, двухфакторный дисперсионный анализ с поправкой Гейссера-Гринхауса и двухэтапный повышающий метод Бенджамини, Кригера и Йекутиели с поправкой на множественные сравнения. p значение: ^# ≤ 0,05 сравнение легкого и крови; * ≤ 0,05 генотип-зависимое сравнение в легких; ^Φ ≤ 0,05 генотип-зависимое сравнение в крови. Все данные имеют n, ≥ 6 мышей, два независимых эксперимента.Все данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего.

Для исследования фенотипов CD4 ⁺ T _RM в отсутствие LEC MHC-II мы использовали высокоразмерную панель MSFC с 21 параметром, включающую антитела к маркерам CD4 ⁺ T _RM, происхождение Т-клеток — определяющие факторы транскрипции (LDTF) и маркеры активации и пролиферации (рис. 4a). Анализ общего количества CD4 ⁺ Т-клеток и CD4 ⁺ T _RM в легких на 105 день выявил сопоставимые частоты между генотипами (дополнительный рис.6г). Затем мы использовали Phenograph для идентификации отдельных кластеров CD4 ⁺ Т-клеток на основе уникальных профилей экспрессии и количественно оценили их относительную численность в зависимости от генотипа. Кластеризация конкатенированного легкого (ivCD45.2 ^—) на фенографе CD44 ⁺ CD11a ⁺ CD4 ⁺ Т-клетки идентифицировали 21 отдельный кластер Т-клеток памяти CD4 ⁺ (дополнительный рисунок 7a), ни один из которых не является уникальным для либо генотип, и все они отрицательны по CD62L. Для дальнейшего анализа мы сосредоточились на 20 кластерах при> 0.Частота 5% (рис. 4б). Примечательно, что 17 из 20 кластеров Т-клеток памяти CD4 ⁺ коэкспрессировали ≥2 LDTF (кластер 17 был положительным для всех протестированных LDTF) (рис. 4b). Среди них кластеры 10 и 19 были CD69 ^— и представляли клетки T _EM, в то время как остальные 15 кластеров включали клетки T _RM, состоящие из 2 CD103 ⁺ T _reg — ³¹, 1 T _H 1 / 17-, 1 T _H 2 / 17-, 8 T _H 1/2 и 3 T _H 1/2/17 легкого T _RM кластеров в гомеостазе.Таким образом, наши результаты подчеркивают наличие сложной клональной пластичности и мультипотентности в CD4 ⁺ T _RM клеток легких. Следует отметить, что кластеры 9 и 12 были отрицательными для всех протестированных LDTF; однако нельзя исключить положительный эффект для других LDTF, не включенных в нашу панель, таких как BCL6.

Количественная оценка относительных частот выявила значительные нарушения в 8 из 20 кластеров Т-клеток памяти CD4 ⁺ из-за делеции LEC MHC-II (рис. 4b). В то время как мыши MHC-II ^ΔEpi продемонстрировали значительное расширение кластеров T _H 1/2/17 T _RM 1 и 4 и кластера 8 T _H 1/17 T _RM, они выявили значительную сжатие в кластерах 3 T _H 1/2 T _RM (3, 5 и 7) и кластере 6 T _H 1 T _RM (рис.4б). Следует отметить, что все кластеры CD4 ⁺ T _RM, увеличенные у мышей MHC-II ^ΔEpi, были Ki67 ^–, что позволяет предположить, что они не были результатом неограниченной пролиферации при гомеостазе ткани. Кроме того, ни один из кластеров клеток T _reg T _RM не был затронут делецией LEC MHC-II, подразумевая, что наблюдаемые эффекты, вероятно, не зависели от подавляющих функций T _reg. Таким образом, наши результаты предполагают, что LEC MHC-II налагает ингибирующие ограничения на пластичность и мультипотентность клеток CD4 ⁺ T _RM (определяемую как коэкспрессия ≥2 LDTF).

Затем мы исследовали, вызывает ли делеция LEC MHC-II нарушения в компартменте циркулирующих CD4 ⁺ Т-клеток, выполнив кластеризацию фенографа внутрисосудистого (ivCD45.2 ⁺) CD44 ⁺ CD11a ⁺ CD4 ⁺ Т-клеток, собранных из легких тех же мышей. Мы идентифицировали 21 отдельный кластер (дополнительный рис. 7b), ни один из которых не является уникальным для любого генотипа. В отличие от легких, только 11 из 21 кластера Т-лимфоцитов CD4 ⁺ продемонстрировали мультипотентность (рис.4c), причем 10 из 21 кластера положительны только для одного из этих LDTF (рис. 4c). Сравнение относительных частот мультипотентности выявило резкие различия в допустимой степени пластичности, приписываемой Т-клеткам памяти CD4 ⁺, на основании: (i) статуса LEC MHC-II и (ii) анатомического места проживания Т-клеток. Например, в то время как 81% клеток MHC-II ^{fl / fl} CD4 легких ⁺ T _RM проявляли мультипотентность (из которых 20% были T _H 1/2/17), доля значительно выше (88 %) MHC-II ^ΔEpi CD4 легких ⁺ T _{Клетки RM} коэкспрессировали ≥2 LDTF (из которых 38% были T _H 1/2/17) (дополнительный рис.7в). Независимо от их статуса LEC MHC-II, только ~ 61% всех CD4 ⁺ Т-клеток с памятью крови проявляли такую пластичность (ни один из которых не был T _H 1/2/17) ( Дополнительный рис. 7c). Сравнение фенотипов внесосудистых (тканевых) и внутрисосудистых (циркулирующих) CD4 ⁺ Т-клеток в легких мышей MHC-II ^{fl / fl} и MHC-II ^ΔEpi показало, что тканевые клетки имели большую сложность, чем циркулирующие пулы. (о чем свидетельствует Tbet ⁺ Gata3 ⁺ RORγT ⁺ тройной положительный CD4 ⁺ T-клетки, соответствующие перекосу T _H 1/2/17) (дополнительный рис.7c) со стабильно высокой мультипотентностью (рис. 4d), которая усугублялась потерей LEC MHC-II (рис. 4d и дополнительный рис. 7c). Таким образом, наши результаты (i) подтверждают презентацию антигена LEC как критического регулятора пластичности клеток CD4 ⁺ T _RM и (ii) подчеркивают существование различных селективных давлений против CD4 памяти ⁺ пластичности Т-клеток в кровообращении по сравнению с барьерные ткани того же иммунокомпетентного хозяина.

LEC MHC-II может управлять пластичностью клеток CD4 ⁺ T _RM двумя способами: (i) ограничивая пластичность уже существующих T _H 17-определенных CD4 ⁺ T _RM клеток во время памяти напоминает или вместо этого (ii) регулируя развитие мультипотентных клеток CD4 ⁺ T _RM из клеток T _eff ²⁹.Чтобы проверить эти возможности, мы сначала сгенерировали клетки CD4 ⁺ T _RM у мышей C57BL / 6J, MHC-II ^{fl / fl} и MHC-II ^ΔEpi и попытались изучить, есть ли вновь установленные CD4 ⁺. Клетки T _RM были исключительно T _H 17-специфицированными (дополнительный рис. 8a ) . В соответствии с представлением о том, что клетки CD4 ⁺ T _RM не являются исключительно специфическими для T _H 17, мы наблюдали гетерогенность и пластичность в клетках CD4 ⁺ T _RM даже на 56-й день (дополнительный рис.8б, в). Кроме того, мы обнаружили умеренное, но значительное увеличение клеток T _H 1/2/17 CD4 ⁺ T _RM у мышей MHC-II ^ΔEpi даже без последующего повторения памяти Sp23A (дополнительный рисунок 8c – e ). , предполагая, что клетки CD4 ⁺ T _RM являются пластичными по своей природе, а LEC MHC-II может регулировать развитие мультипотентности из инфильтрирующих ткань клеток T _eff. Чтобы подтвердить это, мы сгенерировали клетки CD4 ⁺ T _RM у мышей MHC-II ^{fl / fl} и MHC-II ^ΔEpi перед делецией LEC MHC-II, а затем предоставили экспозиции отзыва памяти Sp23A в присутствии ингибитор выхода из лимфатических узлов FTY720 (дополнительный рис.9а). Это лишило CD4 ⁺ Т-клеток доступа к системному кровообращению (дополнительный рис. 9b – d), так что только предварительно установленные легочные CD4 ⁺ T _RM клетки могли вносить вклад в ответы на воспоминания и пластичность в зависимости от LEC MHC. -II статус. Никаких различий в фенотипах клеток CD4 ⁺ T _RM между MHC-II ^{fl / fl} и MHC-II ^ΔEpi легких не наблюдалось из-за делеции LEC MHC-II (дополнительный рис. 9e – h ) . Вместе эти наблюдения предполагают, что LEC MHC-II не управляет фенотипами установленных клеток T _RM, а скорее ограничивает мультипотентность клеток CD4 ⁺ T _RM, развивающихся из клеток T _eff во время первичных встреч и встреч с воспоминаниями.

LEC MHC-II направляет перекос CD4 в легких

⁺ T _RM клеточные ответы

Далее мы исследовали активность мультипотентных клеток T _RM при рестимуляции нелетально несоответствующим серотипом Spn (Sp35B) по порядку вызвать гетеротипический ответ. Мы профилировали CD4 ⁺ Т-клеток легких через 8 часов после заражения (рис. 4a), когда Spn -специфические T _RM клетки уже способствуют привлечению нейтрофилов ^11,19.Конкатенированные легкие CD62L ^— CD44 ⁺ CD11a ⁺ CD4 ⁺ Т-клетки включали 26 отдельных кластеров (дополнительный рис. 10a), ни один из которых не является уникальным для любого генотипа. В отличие от покоящихся клеток T _RM, ни один кластер CD69 ⁺ в инфицированном легком не был тройным положительным для Tbet, Gata3 и RORγT (дополнительный рис. 10b, c), что свидетельствует о быстром переходе от обширной мультипотентности к более ограниченным фенотипам с один или два доминирующих LDTF.

Количественная оценка относительных частот выявила значительные нарушения в 4 из 15 кластеров Т-клеток CD69 ⁺ (дополнительный рис.10b) в легких MHC-II ^ΔEpi. Из них T _H 17 кластеров 3 и 8 и T _H 1 кластер 7 были обогащены MHC-II ^ΔEpi легких, в то время как T _H 1/17 кластера 6 был уменьшен по сравнению с MHC-II. ^{эт / эт} однопометников. Количественная оценка совокупных частот выявила значительное увеличение клеток T _H 17 с сопутствующим сокращением менее определенных клеток T _H 1/17 в легких MHC-II ^ΔEpi (дополнительный рис.10в). Кумулятивные частоты каждого отдельного фактора транскрипции в Т-клетках RORγT ⁺ дополнительно указывают на смещение в сторону T _H 17 и от T _H 1 в отсутствие LEC MHC-II (рис. 4e) на основе содержания LDTF. . Это дополнительно подтверждается сильной отрицательной корреляцией клеток Tbet ⁺ T _H 17 с одноположительными (SP) T _H 17 клеток RORγT ⁺ по воспоминаниям (дополнительный рис. 10d). Следует отметить, что эти различия не зависели от вовлечения CD4 ⁺ Т-клеток в крови, поскольку не наблюдались зависимые от генотипа различия в легочных внутрисосудистых клетках памяти (т.v.CD45.2 ⁺ CD62L ^— CD44 ⁺ CD11a ⁺ CD4 ⁺) тех же мышей (дополнительный рисунок 11). Таким образом, на основе LDTF, отсутствие LEC MHC-II преувеличивает ответы клеток легкого T _H 17 за счет активности T _H 1.

Чтобы определить клоны Т-клеток по экспрессии цитокинов, мы использовали внутриклеточное окрашивание цитокинов с помощью стимулированных PMA / иономицином Т-клеток легких и крови CD4 ⁺ от опытных мышей MHC-II ^ΔEpi и MHC-II ^{fl / fl}.В разных условиях большинство этих CD4 ⁺ Т-клеток были либо IFN-γ ⁺, либо IL-17A ⁺, за которыми следовали IFN-γ ⁺ IL-17A ⁺ двойными экспрессорными клетками (рис. 4f). ). Лишь очень немногие клетки экспрессировали IL-5 или IL-13. В соответствии с отсутствием MHC-II на LEC, что приводит к перепрограммированию клеток T _RM, легочные CD4 ⁺ T-клетки мышей MHC-II ^ΔEpi экспрессировали повышенный уровень IL-17A и снижали IFN-γ при стимуляции (рис. 4f ). Последнее открытие было подтверждено антиген-специфической стимуляцией ex vivo CD4 ⁺ Т-клеток (дополнительный рис.12). Очень последовательно активность T _H 1 притуплялась в CD4 ⁺ Т-клетках из легких, лишенных LEC MHC-II.

Отсутствие LEC MHC-II нарушает регуляцию барьерного иммунного ландшафта

CD4 ⁺ T _{Клетки RM} обеспечивают микробный клиренс за счет ускорения врожденного иммунитета ^1,2. Мы исследовали, регулирует ли LEC MHC-II и его регуляция активности клеток CD4 ⁺ T _RM врожденный иммунный клеточный ответ на инфекции, вызываемые воспоминаниями.В то время как легкие MHC-II ^{fl / fl} и MHC-II ^ΔEpi показали сравнимый клиренс Sp35B (рис. 5a) и клетки ЖБАЛ (рис. 5b), количественная оценка внесосудистых миелоидных клеток в инфицированном легком с использованием проточной цитометрии показала значительные нарушения иммунного ландшафта легких мышей MHC-II ^ΔEpi в течение 8 часов после гетеротипической инфекции (фиг. 5c и дополнительные фиг. 13, 14). Легкие MHC-II ^ΔEpi обладали более высокой частотой эозинофилов и резидентных в ткани альвеолярных макрофагов, но они демонстрировали пониженное накопление множества связанных с моноцитами клеток, включая воспалительные моноциты Ly6C ⁺, интерстициальные макрофаги, происходящие из моноцитов, и полученные из моноцитов ДК, в дополнение к восстановленным обычным ДК CD11b ⁺ и плазмоцитоидным ДК (рис.5в). Эти результаты предполагают, что делеция LEC MHC-II имеет далеко идущие последствия для барьерного иммунитета. Следует отметить, что эти изменения происходили ниже реактивации клеток CD4 ⁺ T _RM, поскольку неинфицированные легкие не проявляли воспаления (дополнительный рис. 6e ) или уменьшения количества клеточных компартментов, связанных с моноцитами (дополнительный рисунок 15a, b), хотя обогащение эозинофилов было очевидным (дополнительный рис. 15a, b). Чтобы связать кластеры CD4 ⁺ Т-клеток с наблюдаемой дисрегуляцией барьерного иммунного ландшафта при воспроизведении памяти, мы выполнили корреляционный анализ для каждой линии CD69 ⁺ CD4 ⁺ Т-клеток и всех изменений миелоидных клеток у одних и тех же мышей (рис. .5г). В соответствии с представлением о том, что клетки RORγT ⁺ T _reg подавляют ответы T _H 17 ³², клетки RORγT ⁺ T _reg обратно коррелировали с ответами нейтрофилов. Кроме того, в соответствии с Tbet, способствующим притоку моноцитов ³³, T _H 1/17 обнаруживает прямую корреляцию с моноцитами Ly6C ⁺ и происходящими из моноцитов CD11b ⁺ DC. Интересно, что мы наблюдали сильную и прямую корреляцию между эозинофилами и клетками T _H 17 и нейтрофилами легких с LDTF-отрицательными (TN) CD4 ⁺ T _H клетками, что позволяет предположить возможное влияние T-клеток на миелоидные клетки.

Фиг. 5: Мыши MHC-II ^ΔEpi демонстрируют дисрегулируемый барьерный иммунитет.

a Воздуховод Sp35B нагрузка 8 л.с. b Общая клеточность бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), макрофаги, нейтрофилы (ПЯН) и лимфоциты 8hpi Sp35B. с . Частоты популяции миелоидных клеток большого легкого (в / в CD45.2 ^–) идентифицировали 8hpi Sp35B, двусторонний тест Манна – Уитни. Обратите внимание, что использованные в этих экспериментах мыши принадлежали к обоим полам и были разного размера в конечной точке эксперимента (возраст ~ 6-8 месяцев при эвтаназии).Это отразилось на различиях в размерах легких, и, следовательно, данные о частоте, приведенные здесь, и абсолютные числа на дополнительном рисунке 14 используются для вывода. d Представление тепловой карты двустороннего корреляционного анализа Пирсона частот легкого (в / в CD45.2 ^—) активации (CD69 ⁺) CD4 ⁺ линий Т-лимфоцитов с частотами основных миелоидных клеток, идентифицированных на рис. . 5c в легких 8hpi Sp35B. p -значение: * ≤ 0,05, ** ≤ 0,01, *** ≤ 0.001. e Частоты внутрисосудистых (внутривенно CD45.2 ⁺) иммунных клеток, изображенные как фракция внутривенно CD45.2 ⁺ клеток 8hpi Sp35B. двусторонний тест Манна – Уитни. f Отношение нейтрофилов к лимфоцитам в крови (NLR), отношение лимфоцитов к моноцитам (LMR), отношение эозинофилов к моноцитам (EMR) и отношение эозинофилов к лимфоцитам (ELR) в ivCD45.2 ⁺ фракция легких 8hpi Sp35B. двусторонний тест Манна – Уитни. Во всех экспериментах участвовало n, ≥ 8 мышей, 2 независимых эксперимента.Все данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего.

Пониженные моноциты легких и постоянно высокий уровень эозинофилов в легких MHC-II ^ΔEpi вызывают особенности, о которых сообщалось у пациентов с иммунотерапией блокадой контрольных точек (CBI) ^34,35,36,37 и пневмонитом с ингибиторами контрольных точек (CIP) ³⁸. Мы исследовали частоту лейкоцитов во фракции крови (ivCD45.2 ⁺) легких MHC-II ^{fl / fl} и MHC-II ^ΔEpi на предмет признаков, предложенных в качестве надежных клинических биомаркеров для CBI ^{34,35,36 , 37,39,40}.Соответственно, фракция крови MHC-II ^ΔEpi в легких фенокопировала особенности CBI, что проявлялось в наличии повышенных частот эозинофилов, пониженных частот моноцитов, повышенного соотношения лимфоцитов к моноцитам, повышенного соотношения эозинофилов к моноцитам и повышенного соотношения эозинофилов к лимфоцитам. соотношения во время инфекции (рис. 5e, f и дополнительный рис. 15c, d). Таким образом, наши результаты демонстрируют, что воспроизведение памяти клеток CD4 ⁺ T _RM, увеличенных в отсутствие LEC MHC-II, запускает фенокопирующие особенности дисрегуляции барьерного иммунитета CBI, подчеркивая сложные (и не совсем понятные) внутри- и межлейкоцитарные взаимодействия, опосредующие барьерный иммунитет. .

LEC MHC-II функционирует в посттрансляционной связи с PD-L1

Сходство иммунной дисрегуляции у инфицированных мышей MHC-II ^ΔEpi и пациентов с CBI и CIP привело нас к дальнейшему исследованию молекул контрольных точек на LEC. LEC MHC-II сильно коррелировал с LEC PD-L1 на всех временных точках и для всех LEC-типов (рис. 6a). Более высокие уровни PD-L1 на MHC-II ^{, высокие} LEC также были подтверждены в легких человека, которые имели аналогичные положительные корреляции между двумя сигналами (рис.6б). Когда мы исследовали поверхностную экспрессию PD-L1 на LEC мышей MHC-II ^ΔEpi, мы неожиданно наблюдали потерю этой иммунной контрольной точки на альвеолярных LEC во время гомеостаза и пневмонии (рис. 6c и дополнительный рис. 16a). Это соединение также распространяется на другие проблемы с легкими (Supplementary Fig. 17, ) , подтверждая эволюционно консервативное соединение между MHC-II и PD-L1 на LECs, ведущее к непредвиденному LEC-специфическому прерыванию передачи сигналов контрольных точек. Мы стремились выяснить механизм, лежащий в основе потери PD-L1 на MHC-II ^ΔEpi LEC.Была сопоставимая экспрессия мРНК Pd-l1 в LEC MHC-II ^ΔEpi и MHC-II ^{fl / fl} (дополнительный рис. 16b), что свидетельствует о посттранскрипционных эффектах. Мы предположили, что PD-L1 зависит от LEC MHC-II для локализации на поверхности, и проверили это с использованием моноклонального антитела, которое связывается с внеклеточными доменами PD-L1 ⁴¹. В соответствии с нашей гипотезой, хотя большая часть PD-L1 альвеолярных LEC MHC-II ^{fl / fl} была экспонирована на поверхности, почти все PD-L1 в MHC-II ^ΔEpi альвеолярных LEC были захвачены внутриклеточно (рис.6г). В дополнение к неудачной доставке PD-L1 на поверхность клетки, дистальные LEC демонстрируют пониженное содержание внутриклеточного PD-L1 (дополнительный рис. 16c), что согласуется с нестабильностью и деградацией PD-L1 в MHC-II ^ΔEpi LEC. Эти данные предполагают, что поверхностное представление молекулы контрольной точки PD-L1 полностью зависит от уровней экспрессии MHC-II в LEC. Это отсутствие LEC PD-L1 может вносить вклад в фенотипы, возникающие в результате потери LEC MHC-II, что доказано на мышах с дефицитом PD-1 ⁴² с соответствующим анамнезом пневмонии (рис.6e), демонстрирующий большую пластичность клеток памяти CD4 ⁺ T _RM (рис. 6f и дополнительный рис. 18) и мультипотентность (рис. 6g) в их легких, но не в крови, как у мышей MHC-II ^ΔEpi. Взятые вместе, MHC-II на LEC проявляет двусторонний эффект на иммунитет, направляя адаптивный иммунитет через презентацию антигена и регулируя адаптивный иммунитет через PD-L1.

Рис. 6: LEC PD-L1 функционирует в посттрансляционном взаимодействии с MHC-II.

Диаграмма рассеяния , коррелирующая MHC-II и PD-L1 на LEC в девяти временных точках, обозначенных на рис.2d ( n = 54 мыши, два независимых эксперимента). Обозначены двусторонний коэффициент корреляции Пирсона (r) и p значения. b Уровни PD-L1 на LEC человека ( n = 7). Двусторонний знаковый ранговый критерий Уилкоксона для согласованных пар. Диаграмма рассеяния, коррелирующая MHC-II и PD-L1 на человеческих LEC ( n = 7). Обозначены односторонние значения коэффициента корреляции Пирсона (r) и p . c Гистограмма поверхностных уровней PD-L1 на LEC от наивных и инфицированных Sp19F мышей MHC-II ^{fl / fl} и MHC-II ^ΔEpi 48hpi. n ≥ 4 мыши, два независимых эксперимента. d Контурные графики субклеточной локализации нативного PD-L1 в альвеолярных LEC, выделенных из Sp19F-инфицированных мышей MHC-II ^{fl / fl} и MHC-II ^ΔEpi 48hpi. n ≥ 8 мышей, два независимых эксперимента; среднее ± стандартное отклонение. e Используемая схема экспериментальной временной шкалы. f Круговые диаграммы для средних частот отдельных легких (внутривенно CD45.2 ^—) CD4 ⁺ T _RM клеток и крови (т.е.v.CD45.2 ⁺) CD4 ⁺ T _EM клонов клеток у мышей PD-1 ^{+ / +} и PD-1 ^{— / —} на 85 день, как было идентифицировано с использованием ручного стробирования. способ ANOVA с ЛСД тестом Фишера. p — значение: ^# ≤ 0,05 для сравнения между легким и кровью; * ≤ 0,05 для генотип-зависимого сравнения в легких; n ≥ 5 мышей, два независимых эксперимента. г Относительные индексы мультипотентности для легких (в / в CD45.2 ^—) CD4 ⁺ T _{Клетки RM} ( кружки, ) и крови (т.е.v.CD45.2 ⁺) CD4 ⁺ T _{Ячейки EM} ( треугольник ) в PD-1 ^{+ / +} ( белый ) и PD-1 ^{— / —} ( красный ) мышей на 85 день, n ≥ 5 мышей, 2 независимых эксперимента, односторонний дисперсионный анализ с тестом множественного сравнения Холма-Сидака. Все данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего.

Пористый гидрогель из наночастиц желатина из тантала, интегрированный с эндотелиальными клетками, полученными из мезенхимальных стволовых клеток, для создания васкуляризированной ткани in vivo | Регенеративные биоматериалы

Аннотация

Идеальный материал каркаса ангиогенеза должен обладать механической прочностью и обеспечивать соответствующие физиологические микропористые структуры, имитирующие среду внеклеточного матрикса.В этом исследовании мы сконструировали интегрированный трехмерный каркасный материал с использованием пористого тантала (pTa), наночастиц желатина (ЗНЧ) гидрогеля и засеянных мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга (BMSC), производными эндотелиальными клетками (ECs) для инженерии сосудистой ткани. Характеристики и биосовместимость гидрогеля рТа и ЗНЧ оценивали с помощью механических испытаний, сканирующей электронной микроскопии, набора для подсчета клеток и анализа живых клеток. ЭК, происходящие от BMSC, идентифицировали с помощью проточной цитометрии и анализа ангиогенеза.ЭК, происходящие от BMSC, высевали на гидрогелевый каркас pTa-GNP и имплантировали подкожно голым мышам. Через четыре недели после операции материал каркаса оценивали гистоморфологически. Наблюдалась превосходная биосовместимость каркаса гидрогеля pTa-GNPs. Наши результаты in vivo показали, что через 28 дней после имплантации образование стабильной капиллярно-подобной сети в материале каркаса может быть значительно ускорено. Новый интегрированный гидрогелевый каркас pTa-GNPs является биосовместимым с хозяином и проявляет биомеханические и ангиогенные свойства.Более того, в сочетании с ECs, происходящими из BMSCs, он может конструировать сконструированную сосудистую ткань in vivo . Это исследование может обеспечить основу для применения pTa при регенерации кости и аутологичных BMSC в тканеинженерных сосудистых трансплантатах.

Введение

Ожидается, что тканевая инженерия (TE) станет новым подходом к созданию альтернативных тканей для лечения врожденной недостаточности или патологических тканей. Для регенерации тканей ключевой проблемой ТЕ является сосудистый дефицит инженерной структуры [1].Учитывая ограничение диффузионного расстояния, восстановление сети кровеносных сосудов является сложной задачей для обеспечения снабжения питательными веществами, газообмена и удаления продуктов жизнедеятельности [2, 3]. Чтобы преодолеть проблему васкуляризации, многие ученые предложили многочисленные методы, такие как встраивание ангиогенных факторов в стенты для ускорения роста микрососудов, технологии производства полимеров, включая сосудистые сети, и васкуляризацию матрикса перед инокуляцией клеток [4 ].Трехмерный (3D) каркас — важный элемент в исследованиях TE. Он может обеспечить матрицу для клеточного закрепления, миграции и роста. Кроме того, он способствует неоваскуляризации и регенерации тканей, снабжая их питательными веществами и кислородом. Кроме того, волокнистые пористые структуры 3D-каркаса могут имитировать среду внеклеточного матрикса (ECM) и значительно улучшать функции клеток, включая ангиогенез [5, 6].

Тантал (Ta) получил широкое внимание в биомедицине из-за его превосходной биосовместимости и химической стабильности [7].С 1940 года Та используется в клинической практике и широко применяется в диагностике и имплантации, например, в радиографических маркерах, сосудистых зажимах, эндоваскулярных стентах, краниопластических пластинах, ортопедии и дентальных имплантатах [8]. По сравнению с традиционными металлическими материалами для имплантатов (например, нержавеющей сталью, титановыми сплавами и сплавами на основе кобальта) Ta обладает превосходной пластичностью, биосовместимостью по прочности и высокой коррозионной стойкостью. Пористые металлические материалы привлекают большое внимание среди биоматериалов.Пористый тантал (pTa) считается идеальным материалом для ортопедических имплантатов с многообещающей совместимостью и механической опорой [9]. Клинические исследования показали, что материал имплантата pTa обладает хорошей биосовместимостью и хорошо интегрируется с костной тканью. Кроме того, эта комбинация обладает превосходной долговременной стабильностью и ее нелегко ослабить [10, 11]. Ангиогенез — это первичный элемент регенерации костей; внутримембранозное и внутрихондральное окостенение происходит вокруг разрастания сосудистых тканей [1].При регенерации кости, такой как дефекты кости, идеальный каркас должен иметь фиброзно-пористые структуры, в которых следует проводить реконструкцию васкуляризации и формирование новой кости [12]. Однако pTa не имеет соответствующей структуры, чтобы имитировать микроструктуру ECM. Следовательно, pTa не обладает свойством стимулировать ангиогенез и ограничивает его применение при регенерации кости.

В последнее время во многих исследованиях были предприняты многочисленные попытки васкуляризированных структур in vitro .Один из методов заключается в инокуляции посевных клеток на подходящую основу с механическими свойствами, стимулирующую быстрый рост клеток и направленную дифференцировку in vitro . Следовательно, при имплантации in vivo спроектированная структура подвергнется реконструкции и созреванию для восстановления или формирования функциональной ткани [13]. Присущая эндотелиальным клеткам (ЭК) ангиогенная способность может использоваться для предотвращения ангиогенеза, индуцированного заранее изготовленными каналами или факторами роста. Однако клиническое применение зрелых ЭК из аутологичной сосудистой ткани имеет определенные ограничения; (i) процесс изоляции требует инвазивной операции; (ii) потенциал распространения зрелых ЭК относительно низок; и (iii) получение достаточного количества клеток из небольшого количества биопсий аутологичных тканей является сложной задачей.Эти ограничения побудили к поиску источников ЭК с более пролиферативными и ангиогенными способностями. Гемопоэтические стволовые клетки (HSC), полученные из костного мозга, эндотелиальные клетки-предшественники, мононуклеарные клетки и мезенхимальные стволовые клетки (MSC) могут дифференцироваться в EC. Между тем, мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (BMSCs) являются плюрипотентными предшественниками, которые могут дифференцироваться в различные типы клеток, происходящие из мезодермы, включая остеоциты, хондроциты, адипоциты и стромальные клетки [14]. Тем не менее, ангиогенный потенциал EC, происходящих из BMSCs, в материале 3D каркаса in vivo сообщается редко.

Коллоидные гели представляют собой особый класс гидрогелевых материалов, демонстрирующих различные применения, включая обработку керамики, пищевую промышленность и биомедицинскую инженерию. Предыдущие исследования подтверждают, что гидрогель обеспечивает физиологически релевантную микросреду для регенерации клеток и тканей [15, 16]. Однако традиционные постоянные гидрогели с широким диапазоном высокой плотности сшивания не могут адаптироваться к сложности местной окружающей среды и нерегулярным структурам костей из-за того, что их эластичность более выгодна, чем вязкоупругость [17].Адаптируемые гидрогели могут проявлять идеальную вязкоупругость и выдерживать сложные механические среды и неправильные формы из-за обратимости физических сетевых соединений [18]. Ранее мы сообщали о новом классе коллоидных гелей, собранных из наночастиц желатина (ЗНЧ) электростатического притяжения. Эти гели состоят из сетки пористых частиц, диспергированных в непрерывной фазе водного растворителя. Эта микроструктура частиц придает коллоидным гелям превосходные свойства, такие как регулируемая вязкоупругость, включение других компонентов и удивительные механические свойства.Обратимая особенность межчастичных сил приводит к разжижению коллоидных гелей при сдвиге и самовосстановлению, тем самым делая эти гели пригодными для инъекций и формованием. Что еще более важно, ЗНЧ в коллоидных гелях могут поддерживать высвобождение терапевтических средств, включая белки или низкомолекулярные препараты, что является привлекательной особенностью для регенеративной медицины [19, 20]. Однако адаптация к механической среде и местной структуре in vivo остается проблемой.

Таким образом, чтобы расширить применение рТа в регенерации костей, мы сконструировали искусственные клеточные каркасы, которые могут имитировать микроструктуру естественной ткани для применения сосудистого ТЕ.В настоящем исследовании комбинация гидрогеля pTa и GNPs была разработана для создания материала трехмерного каркаса и, как ожидается, будет иметь преимущества двух материалов с особой механической прочностью для регенерации клеток и тканей, обеспечивая физиологически релевантную микросреду. Характеристики и биосовместимость гидрогелевого каркаса рТа и ЗНЧ оценивали с помощью механических испытаний, сканирующей электронной микроскопии (SEM), набора для подсчета клеток и анализа живых клеток. Затем мы предложили гидрогелевый каркас pTa-GNPs в сочетании с дифференцированными эндотелиальными BMSC.Используя исследование in vivo на животных, мы определили, могут ли EC, происходящие из BMSC, способствовать ангиогенезу в каркасе.

Материалы и методы

Подготовка проб и морфологический анализ Ta

Столбчатые и дискообразные структуры образцов pTa были получены с помощью компьютерной программы проектирования. Ячеечная структура (объемно-центрированная кубическая структура; рис. 1а) была импортирована в файл .stl, а образец модели был создан с помощью программного обеспечения автоматизированного проектирования (САПР).Образцы пористого Та были созданы с помощью выбранного лазерного плавления (SLM; AM400, Renishaw, Великобритания) на основе предварительно разработанных данных САПР. Мощность лазера и скорость лазерного сканирования были установлены на 320 Вт и 500 мм / с. Между тем, толщина слоя порошка Та и расстояние штриховки составляли 30 и 70 мкм соответственно. Цилиндры pTa ( φ 6 мм × H 10 мм) и диски pTa ( φ 6 мм × H 2 мм; рис. 1b и c) использовались в механических испытаниях и биологических экспериментах, соответственно.Образцы дисков автоклавировали при 121 ° C в течение 30 минут для подготовки к экспериментам на цитотоксичность и in vivo, экспериментов. Для конструкции пористость, размер стойки и диаметр пор pTa составляли 88,6%, 430 мкм и 1300 мкм соответственно. Гравиметрическим методом рассчитывалась пористость цилиндрических образцов из pTa [21]. SEM (SU3500, Hitachi, Япония) использовали для изучения размеров и морфологии образца, а изображение J 1.8 (Национальные институты здравоохранения, США) использовали для анализа данных.

Рисунок 1.

Дизайн образца pTa. ( a ) Объемно-центрированная кубическая элементарная ячейка. ( b ) CAD-модель дискообразной pTa. ( c ) Дискообразный pTa, использованный в биологическом эксперименте ( φ 6 мм × H 2 мм).

Рисунок 1.

Дизайн образца pTa. ( a ) Объемно-центрированная кубическая элементарная ячейка. ( b ) CAD модель дискообразной рТа. ( c ) Дискообразный pTa, использованный в биологическом эксперименте ( φ 6 мм × H 2 мм).

Механические испытания

Механические свойства пяти цилиндрических pTa ( φ 6 мм × 10 мм) оценивали с помощью испытания на сжатие. Для проведения механических испытаний использовалась универсальная испытательная машина (ETM 503A, Wance, Китай), постоянная скорость деформации составляла 1 мм / мин. Модуль упругости при сжатии анализировался по линейному участку кривой напряжение – деформация.

Реологические свойства ЗНЧ измеряли с помощью реометра (DHR, TA Instruments, США).Все измерения проводились с использованием плоской пластины диаметром 20 мм при 25 ° C с зазором 800 мкм. Во-первых, модуль накопления G ‘ и модуль потерь G’ были определены с использованием теста колебательной временной развертки в течение 300 с при постоянной деформации 1 0,5% и постоянной частоте 1 Гц. Впоследствии измерение развертки частоты было выполнено при постоянной деформации 0,5% и диапазоне угловых частот от 0,628 до 628,319 рад / с. Для измерения вязкости эти гели загружали с постоянной скоростью в диапазоне скорости сдвига 0.1–100 с ^— ¹. Самовосстанавливающиеся свойства образца были количественно охарактеризованы путем мониторинга эволюции модуля накопления ( G ″ ) и потери ( G ″ ) гелей во время нескольких циклов деструктивного сдвига (колебательное движение деформации с увеличением деформации от 0,1% до 500% с фиксированной частотой 1 Гц) и восстановления (колебательная временная развертка при 0,5% деформации и частоте 1 Гц) в течение 200 с.

Подготовка ВНП

Для получения ЗНЧ был проведен метод двухступенчатой десольватации [5].Вкратце, 1 г желатина растворяли в 20 мл дистиллированной воды при постоянном нагревании и добавляли 25 мл ацетона для осаждения цепей желатина с высокой молекулярной массой и получения раствора желатина (5% мас. / Об.). Желатин становился растворимым в воде при 40 ° C после удаления супернатанта, а затем pH раствора желатина доводили до 2,5. Впоследствии ЗНЧ образовывались после добавления 75 мл ацетона к раствору желатина при интенсивном перемешивании (1000 об / мин) с постоянной скоростью 3,75 мл / мин.После этого добавляли 660 мкл 25 мас.% Глутарового альдегида для стабилизации ЗНЧ. Непрореагировавшие альдегидные группы блокировали добавлением 100 мл 100 мМ раствора глицина после 16 часов поперечного сшивания ЗНЧ. Затем суспензию ресуспендировали в деионизированной воде встряхиванием после центрифугирования при 5000 об / мин в течение 60 мин. После трех циклов промывки и сушки вымораживанием в течение 48 часов pH суспензии был изменен до 7,0. ЗНЧ были получены и стерилизованы гамма-облучением.

Приготовление гидрогелевого каркаса pTa-GNPs

А 0.13 г лиофилизированных ЗНЧ и 1 мл стерильной воды помещали в шприц и перемешивали путем многократной экструзии. Инъецируемый и формованный гидрогель были изготовлены в течение 30 с. РТа заполняли инъекционным гидрогелем с помощью шприца. Морфологию материала каркаса наблюдали с помощью SEM. Материал каркаса замораживали и разрушали при -80 ° C с последующей сушкой вымораживанием для удаления воды из гидрогеля. Более того, чтобы оценить морфологию поверхности материала каркаса, поперечное сечение было покрыто золотом для улучшения проводимости.

Выделение, культивирование и идентификация BMSC

BMSC были выделены из костного мозга большеберцовой и бедренной костей 6-недельной бестимусной голой мыши. Извлеченный костный мозг центрифугировали с гепарином, затем смешивали и ресуспендировали в растворе, содержащем 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS; Corning, США), DMEM / F12 (HyClone, США) и 1% пенициллин-стрептомицин (HyClone, США). . Культуральную среду промывали фосфатно-солевым буфером (PBS, HyClone, США) через 2 дня для удаления плавающих клеток и заменяли культуральную среду.

Эксперименты по остеогенезу и адипогенной дифференцировке использовали для оценки дифференцировки BMSC. BMSC на 4-м пассаже использовали для индукционных экспериментов. BMSC на 3-м пассаже собирали и культивировали с питательной средой при плотности 5 × 10 ⁴ клеток / лунку в шестилуночных планшетах. Среда для остеогенной индукции используется для идентификации BMSCs после слияния с питательной средой [22].

Окрашивание ализариновым красным и щелочной фосфатазой проводили в индукционной культуре на 14 и 21 день соответственно.При окрашивании ализарином красным удаляли среду, промывали клеточный слой PBS и фиксировали в 4% растворе параформальдегида при комнатной температуре в течение 20 мин. Затем с использованием 0,1% ализарина красного S для инкубации фиксированных клеток при 37 ° C в течение 30 мин. Для окрашивания ALP мы использовали BCIP / NBT ALP Color Development Kit для инкубации фиксированных клеток при 37 ° C в течение 30 мин. Во время адипогенеза BMSC на 3-м пассаже культивировали со средой для адипогенной дифференцировки при плотности 5 × 10 ⁴ клеток / лунку в шестилуночных планшетах.После 3 недель культивирования использовали метод окрашивания масляным красным О для оценки адипогенной способности BMSC.

Дифференцировка и идентификация эндотелиальных клеток

BMSC на 3-м пассаже собирали и культивировали с питательной средой при плотности 5 × 10 ⁴ клеток / лунку в шестилуночных планшетах. Затем клетки культивировали в индукционной среде, включающей 50 нг / мл VEGF (PeproTech, США) и 5% FBS, в течение 7 дней.

Анализ образования капилляров in vitro выполняли с использованием набора для анализа ангиогенеза (Merck Millipore, Германия).Одна лунка 96-луночного планшета заполнялась 50 мкл раствора гелевой матрицы и инкубировалась при 37 ° C в течение 60 мин. Эндотелиально дифференцированные BMSC с количеством клеток 5 × 10 ³ суспендировали в 150 мкл индукционной среды, высевали на гелевый матрикс и инкубировали в течение 12 часов.

Иммунофлуоресценцию проводили для обнаружения экспрессии CD31, который является специфическим для эндотелия маркером в эндотелиально дифференцированных BMSC. Во-первых, эндотелиально дифференцированные BMSC фиксировали добавлением 4% параформальдегида в течение 5 минут и 0.2% Тритон в течение 30 минут до полного проникновения через мембрану. После блокирования в течение 60 минут 10% FBS добавляли первичные кроличьи антитела против CD31 мыши (разведение 1: 100; ab222783, Abcam, UK) и инкубировали в течение ночи при 4 ° C. Затем клетки инкубировали с вторичным антителом козы против кролика, конъюгированным с Alexa Fluor 488 (разведение 1: 200; ab150077, Abcam, UK) после промывания PBS. Наконец, ядра окрашивали 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI), и флуоресцентные изображения получали с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (Eclipse Ti, Nikon, Япония).

Проточная цитометрия BMSC и эндотелиально дифференцированных BMSC

0,5% бычий сывороточный альбумин (BSA) и 2 ммоль / л EDTA добавляли в PBS, и 5 × 10 ^{5 клеток} инкубировали в 100 мкл приготовленного раствора PBS с 5 мкл FITC-конъюгированных анти-CD31 (561813, BD Biosciences, CA), 5 мкл FITC-конъюгированного анти-CD34 (560238, BD Biosciences), 5 мкл APC-конъюгированного анти-CD44 (559250, BD Biosciences), 5 мкл FITC-конъюгированного анти-CD45 (ab25224, Abcam, UK) , 5 мкл PE-конъюгированных анти-CD90 (ab24904, Abcam, UK) в течение 20 мин соответственно.В качестве отрицательного контроля использовали иммуноглобулин G соответствующего изотипа для замены антитела. После обширной промывки PBS проточный цитометр (FACSCanto II, BD Biosciences) использовали для анализа флуоресценции клеток с помощью программного обеспечения FACSDiva (v7.0, BD Biosciences).

Цитотоксичность pTa по набору для подсчета клеток-8

Клеточную токсичность pTa оценивали с использованием культуры BMSCs. BMSC с концентрацией 5,0 × 10 ⁴ / мл при 3-м пассаже высевали в лунки 24-луночного планшета, соответственно, и стерилизованный каркас pTa добавляли в каждую лунку.В контрольную группу мы не добавляли образец pTa. Через 1, 3, 5 и 7 дней культивирования каркас pTa и среду удаляли, и в каждую лунку добавляли свежую культуральную среду с 10% реагентом набора-8 для подсчета клеток (CCK-8; Dojindo, Япония) и инкубировали. на 120 мин. Затем среду, содержащую 10% раствор CCK-8, удаляли из каждой лунки 96-луночного планшета и измеряли с помощью считывающего устройства для микропланшетов (Epoch 2, Biotek, США) при 450 нм.

Характеристики клеточной адгезии на pTa

in vitro

Адгезию клеток оценивали методом прямого контакта.BMSC были использованы для изучения цитосовместимости pTa. BMSC с 1 × 10 ⁵ клеток / мл суспендировали и высевали на pTa.

На 7 день совместного культивирования для промывания образцов использовали PBS, а для их фиксации в течение 120 минут использовали 2% глутаральдегид. Затем образцы были подвергнуты последовательной дегидратации и сушке до критической точки. Для улучшения проводимости образцы были покрыты золотом. Морфологию поверхности наблюдали с помощью SEM.

Анализ живых клеток

гидрогеля ЗНЧ заполняли в лунку 24-луночного культурального планшета, и 5 × 10 ⁵ клеток / мл BMSC суспендировали и инокулировали на поверхность гидрогеля ЗНЧ.Равномерную колонизацию оценивали с помощью анализа живых клеток (Molecular Probes, США) через 1, 3 и 5 дней совместного культивирования. Материал каркаса покрывали раствором кальцеина AM (2 мкМ), а затем инкубировали в течение 30 мин в темноте. Образцы получали с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (Eclipse Ti, Nikon, Япония).

In vivo эксперименты по васкулогенезу

Схема эксперимента была проведена в соответствии с Руководством по исследованиям на животных Китая, и все процедуры экспериментов на животных были одобрены Комитетом по этике животных Даляньского университета.Все животные получили помощь человека в соответствии с «Руководством по уходу за лабораторными животными», которое упоминается Национальным министерством науки. В этом исследовании использовали двадцать 6-недельных самцов бестимусных голых мышей (30 ± 5 г). Материал каркаса pTa был заполнен составным гидрогелем ЗНЧ (13% мас. / Об.). Эндотелиально дифференцированные BMSC и BMSC, диспергированные в виде отдельных клеток в соотношении 50:50, или 100% эндотелиально дифференцированные BMSC или 100% BMSC были приготовлены для контрольных экспериментов клеточного типа. Клетки с концентрацией 5 × 10 ⁵ клеток / мл различных комбинаций суспендировали и высевали на каркас гидрогеля pTa-GNPs.Контрольная группа была сконструирована как гидрогелевый каркас pTa-GNPs без имплантации клеток (таблица 1). После 24 часов совместного культивирования композитный материал каркаса был разделен на четыре группы и имплантирован в подкожную ткань спины путем подкожного разреза. Каждой мыши имплантировали два композитных каркаса (рис. 2). Каждая экспериментальная группа состояла из пяти мышей. Общий протокол эксперимента показан на схемах 1 и 2.

4747

Условия эксперимента .	Группа .	Типы ячеек .	Медиа .
	A	Не	Ростовая среда + эндотелиальная среда 1: 1 об. / Об.
	B	BMSC	Ростовая среда + эндотелиальная среда 1: 1 v / v


BMSC, дифференцированный до EC	Ростовая среда + эндотелиальная среда 1: 1 об. / Об.
D	BMSC, дифференцированная до EC + BMSC	Ростовая среда + эндотелиальная среда 1: 1 об. / Об.

Экспериментальные условия . Группа

. Типы ячеек

. Медиа

. A Не Ростовая среда + эндотелиальная среда 1: 1 об. / Об. B BMSC Ростовая среда + эндотелиальная среда 1: 1 v / v4747 BMSC, дифференцированный до EC Ростовая среда + эндотелиальная среда 1: 1 об. / Об. D BMSC, дифференцированная до EC + BMSC Ростовая среда + эндотелиальная среда 1: 1 об. / Об. Экспериментальные условия . Группа

. Типы ячеек

. Медиа

. Типы ячеек

. Медиа

. A Не Ростовая среда + эндотелиальная среда 1: 1 об. / Об. B BMSC Ростовая среда + эндотелиальная среда 1: 1 об. / Об.4747 BMSC, дифференцированный до EC Ростовая среда + эндотелиальная среда 1: 1 об. / Об. D BMSC, дифференцированная до EC + BMSC Ростовая среда + эндотелиальная среда 1: 1 об. / Об.

Рисунок 2.

Принципиальная схема животной модели. ( a ) Разрез кожной ткани на спине. ( b ) Воздействие на подкожную клетчатку. ( c ) Имплантированный композитный каркасный материал в подкожную ткань. ( d ) Шовный разрез.

Рисунок 2.

Схематическая диаграмма животной модели. ( a ) Разрез кожной ткани на спине. ( b ) Воздействие на подкожную клетчатку. ( c ) Имплантированный композитный каркасный материал в подкожную ткань.( d ) Шовный разрез.

Гистология

Всех мышей каждой группы умерщвляли через 28 дней после операции. Подкожные образцы собирали и фиксировали в 10% растворе формальдегида в фосфатном буфере (pH 7,4). Затем образцы погружали в серию градуированных этанолов для обезвоживания и заливали пластиком, чтобы разрезать твердую ткань. Срезы были нарезаны до толщины 30 мкм для окрашивания по Ван Гизону. Четыре поля зрения каждого среза были выбраны случайным образом и отображены с помощью оптического микроскопа (BX53, Olympus, Япония).

Анализ плотности микрососудов использовали для оценки ангиогенной способности образцов. Структуры просвета сосудов идентифицировали как микрососуды и подсчитывали их количество. Анализ изображения был использован для оценки площади гидрогеля. Чтобы рассчитать плотность микрососудов для каждого образца, мы разделили общее количество микрососудов на общую площадь гидрогеля (выраженную как сосуды / мм ²).

Статистический анализ

Все результаты были выражены как среднее ± стандартное отклонение (SD).Данные групп анализировали с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) с последующими апостериорными множественными сравнениями с использованием критерия Тьюки. P Значения <0,05 считались статистически значимой разницей.

Результаты

Морфология и механические свойства матриксов из pTa

Пористость и размер пор образцов каркасов pTa соответствовали предполагаемой конструкции (таблица 2). Напряжение сжатия и модуль упругости показаны в таблице 3, а кривая напряжения-деформации pTa проанализирована на рис.3b. Морфология поверхности pTa наблюдалась с помощью SEM, и был виден металлический блеск темно-серого цвета (рис. 3c и d).

Рис. 3.

Механические свойства и морфология поверхности pTa. ( a ) Эксперимент по сжатию. ( b ) Кривая «напряжение – деформация». ( c ) Морфология поверхности pTa. ( d ) Показаны плоская морфология и металлический блеск темно-серого цвета. Эти изображения были увеличены в 30, 100 и 200 раз соответственно (масштабная линейка = 100 мкм).

Рис. 3.

Таблица 2.

Средняя пористость, размер стойки и диаметр пор каркасов из pTa

Пористость (%) .		Размер стойки (мкм) .		Диаметр пор (мкм) .
Конструкция	Расчет	Конструкция	Измерение	Конструкция	Измерение
88,6	84,3 ± 3,5	430	84,3 ± 3,5	430	9154 915 415 430	9154 9154 9154 9154 9154 9154 9154 9154 9154 9154 9154 9154

Пористость (%) .		Размер стойки (мкм) .		Диаметр пор (мкм) .
Конструкция	Рассчитать	Модель	Мера	Конструкция	Мера
88,6	84,3 ± 3,5	430	84,3 ± 3,5	430	9154 9154 915 415 430	9154 9154 9154 915 430

Таблица 2.

Средняя пористость, размер стойки и диаметр пор каркасов из pTa

Пористость (%) .		Размер стойки (мкм) .		Диаметр пор (мкм) .
Конструкция	Расчет	Конструкция	Измерение	Конструкция	Измерение
88,6	84,3 ± 3,5	430	84,3 ± 3,5	430	9154 915 415 430	9154 9154 9154 9154 9154 9154 9154 9154 9154 9154 9154 9154

Пористость (%) .		Размер стойки (мкм) .		Диаметр пор (мкм) .
Конструкция	Рассчитать	Модель	Мера	Конструкция	Мера
88,6	84,3 ± 3,5	430	84,3 ± 3,5	430	9154 9154 915 415 430	9154 9154 9154 915 430

Таблица 3.

Среднее напряжение сжатия и модуль упругости каркасов из pTa

Напряжение сжатия (МПа) .	Модуль упругости (ГПа) .
8,01 ± 0,24	1,12 ± 0,01

Напряжение сжатия (МПа) .	Модуль упругости (ГПа) .
8,01 ± 0,24	1,12 ± 0,01

Таблица 3.

Среднее напряжение сжатия и модуль упругости каркасов из pTa

Напряжение сжатия (МПа) .	Модуль упругости (ГПа) .
8,01 ± 0,24	1,12 ± 0,01

Напряжение сжатия (МПа) .	Модуль упругости (ГПа) .
8,01 ± 0,24	1,12 ± 0,01

Характеристика и морфология гидрогелевого каркаса pTa-GNPs

ЗНЧ образуют довольно эластичный, но также самовосстанавливающийся и истончающийся при сдвиге коллоидный гель из-за когезионных взаимодействий между глобально положительно заряженными, но локально амфотерными ЗНЧ [20, 23].Это позволяет экструдировать коллоидный гель ЗНЧ с помощью шприца и легко смешивать с другими формованными материалами. Реологические свойства коллоидного геля ЗНЧ охарактеризованы реометром. Модуль коллоидного геля ЗНЧ не зависел от времени (рис. 4а). Значение накопительного модуля G ‘составляло около 4,5 кПа, а значение накопительного модуля G ″ составляло 0,1 кПа. Тесты с разверткой колебательной частоты показали, что модуль ЗНЧ зависит от низкой частоты при приложении постоянного сдвига (рис.4б). Значение накопительного модуля G ′ было увеличено с 4,5 до 5,5 кПа. Вязкость коллоидного геля ЗНЧ снижалась с увеличением скорости сдвига (рис. 4c). Более того, коллоидный гель ЗНЧ также показал высокую степень механического восстановления после разрушения сети (рис. 4d). Как показано на фиг. 4d, в области I коллоидный гель ЗНЧ показал более высокое значение G ‘, чем G ″. Впоследствии в области II деструктивная деформация сдвига (0,5% в течение 200 с) привела к разрушению сети и превращению твердого геля в жидко-подобный материал ( G ″> G ′).После ослабления разрушающего сдвига GNPs немедленно показали более чем 90% восстановления значения G ‘, что соответствует исходному G ‘.

Рисунок 4.

Характеристика и морфология гидрогелевого каркаса pTa-GNPs. ( a ) Зависимость от времени модуля накопления ( G ′) и потери ( G ″) ЗНЧ. ( b ) Частотная зависимость модуля накопления ( G ′) и потери ( G ″) модуля ЗНЧ.( c ) Вязкость и разжижение при сдвиге ЗНЧ. ( d ) Типичное реологическое измерение, показывающее заживляющее поведение гидрогелей во время цикла разрушающего сдвига и восстановления. ( e ) Гидрогели ЗНЧ обладают способностью к инъекциям и приспособляемостью к неправильной форме до полного затвердевания. ( f и g ) Внешний вид гидрогелевого каркаса pTa и pTa-GNPs. ( h и i ) СЭМ-изображения показали морфологию поверхности гидрогелевого каркаса pTa-GNP и наблюдали характерные микроструктуры.Изображения были увеличены в 30, 100 и 300 раз соответственно (масштабная линейка = 100 мкм).

Рисунок 4.

Характеристика и морфология гидрогелевого каркаса pTa-GNPs. ( a ) Зависимость от времени модуля накопления ( G ′) и потери ( G ″) ЗНЧ. ( b ) Частотная зависимость модуля накопления ( G ′) и потери ( G ″) модуля ЗНЧ. ( c ) Вязкость и разжижение при сдвиге ЗНЧ. ( d ) Типичное реологическое измерение, показывающее заживляющее поведение гидрогелей во время цикла разрушающего сдвига и восстановления.( e ) Гидрогели ЗНЧ обладают способностью к инъекциям и приспособляемостью к неправильной форме до полного затвердевания. ( f и g ) Внешний вид гидрогелевого каркаса pTa и pTa-GNPs. ( h и i ) СЭМ-изображения показали морфологию поверхности гидрогелевого каркаса pTa-GNP и наблюдали характерные микроструктуры. Изображения были увеличены в 30, 100 и 300 раз соответственно (масштабная линейка = 100 мкм).

В данном исследовании мы приготовили гель с концентрацией ЗНЧ 13 мас. / Об.% Для получения коллоидного геля с высокой механической прочностью.Высокая концентрация может устранить структурные изменения после перемешивания под действием сдвига. Гидрогели ЗНЧ обладают способностью к инъекциям и приспособляемостью к неправильной форме до полного затвердевания (рис. 4e). СЭМ-изображения показали гидрогели ЗНЧ и прочно связанный pTa (рис. 4h). Наблюдалась морфология поверхности с диаметром пор 76 ± 15,3 мкм и характерная микроструктура гидрогелей ЗНЧ (рис. 4i).

Идентификация BMSC

Типичная прикрепленная веретенообразная форма клеток, выделенных из образцов костного мозга большеберцовой и бедренной костей мышей, была визуализирована с помощью микроскопа (рис.5а; CKX41, Olympus, Япония). Маркеры BMSC CD44 и CD90 экспрессировались экстрагированными клетками, но CD34a и CD45 экспрессировались редко (фиг. 5b).

Рисунок 5.

Культура и идентификация BMSC. ( a ) Наблюдение под оптическим микроскопом BMSC третьего поколения (масштабная линейка = 100 мкм). ( b ) Идентификация клеточного фенотипа методом проточной цитометрии. CD44 и CD90 экспрессировались, но CD34a и CD45 почти не экспрессировались. ( c ) Щелочная фосфатаза проявлялась после 2 недель культивирования в среде для остеогенной индукции (шкала = 100 мкм).( d ) После 3 недель культивирования в среде для остеогенной индукции окрашивание ализарином красным показало кальцинированные узелки (шкала = 100 мкм). ( e ) Окрашивание масляным красным О показало внутриклеточные липидные капли после 3 недель культивирования в адипогенной индукционной среде (шкала = 100 мкм).

Рисунок 5.

Культура и идентификация BMSC. ( a ) Наблюдение под оптическим микроскопом BMSC третьего поколения (масштабная линейка = 100 мкм). ( b ) Идентификация клеточного фенотипа методом проточной цитометрии.CD44 и CD90 экспрессировались, но CD34a и CD45 почти не экспрессировались. ( c ) Щелочная фосфатаза проявлялась после 2 недель культивирования в среде для остеогенной индукции (шкала = 100 мкм). ( d ) После 3 недель культивирования в среде для остеогенной индукции окрашивание ализарином красным показало кальцинированные узелки (шкала = 100 мкм). ( e ) Окрашивание масляным красным О показало внутриклеточные липидные капли после 3 недель культивирования в адипогенной индукционной среде (шкала = 100 мкм).

Результаты показали, что изолированные клетки костного мозга показали щелочную фосфатазу после 2 недель культивирования в среде для остеогенной индукции (фиг. 5c). После 3 недель культивирования в среде для остеогенной индукции окрашивание ализарином красным показало кальцинированные узелки, что указывает на то, что изолированные клетки находились на стадии минерализации матрикса (рис. 5d). Окрашивание масляным красным О показало внутриклеточные липидные капли через 3 недели культивирования в адипогенной индукционной среде (фиг. 5e).

Оценка ангиогенеза

По сравнению с изолированными клетками, морфология более крупная и круглая, цитоплазма уменьшилась и распространилась по форме булыжника после 7 дней культивирования в васкуляризированной индукционной среде (рис.6а).

Рисунок 6.

( a ) Изображения под световым микроскопом эндотелиально дифференцированных BMSC (масштабная полоса = 100 мкм). ( b и c ) базовая характеристика экспрессии ECs CD31 в BMSC и эндотелиально дифференцированных BMSC с помощью иммунофлуоресценции. Синяя флуоресценция означает DAPI, зеленая означает CD31 (масштабная полоса = 100 мм). ( d ) Анализ проточной цитометрии показал, что конверсия ЭК в группе BMSC составляет 0,3 ± 0,1% (масштабная полоса = 100 мм).( e ) В группе эндотелиально дифференцированных BMSC конверсия ЭК составляет 31,5 ± 1%. ( f ) BMSC оставались в тесте формирования пробирки (шкала = 100 мм). ( г ) Эндотелиально дифференцированные BMSC образовывали видимые трубчатые структуры на матригеле через 12 ч (масштабная линейка = 100 мм).

Рисунок 6.

( a ) Изображения под световым микроскопом эндотелиально дифференцированных BMSC (масштабная линейка = 100 мкм). ( b и c ) базовая характеристика экспрессии ECs CD31 в BMSC и эндотелиально дифференцированных BMSC с помощью иммунофлуоресценции.Синяя флуоресценция означает DAPI, зеленая означает CD31 (масштабная полоса = 100 мм). ( d ) Анализ проточной цитометрии показал, что конверсия ЭК в группе BMSC составляет 0,3 ± 0,1% (масштабная полоса = 100 мм). ( e ) В группе эндотелиально дифференцированных BMSC конверсия ЭК составляет 31,5 ± 1%. ( f ) BMSC оставались в тесте формирования пробирки (шкала = 100 мм). ( г ) Эндотелиально дифференцированные BMSC образовывали видимые трубчатые структуры на матригеле через 12 ч (масштабная линейка = 100 мм).

Иммунофлуоресцентное окрашивание на CD31 проводили для базовой характеристики ЭК. Для окрашивания CD31 BMSC почти не показали специфических результатов (рис. 6b). Однако интенсивность флуоресценции эндотелиально дифференцированных BMSC значительно увеличивалась после 7 дней индукции (фиг. 6c).

В группе BMSCs анализ проточной цитометрии показал, что процент клеток CD31 + составлял 0,3%, а 31,5% клеток CD31 + наблюдались в группе эндотелиально дифференцированных BMSC (рис.6d и e).

Набор для ангиогенеза in vitro применяли для исследования способности BMSC и эндотелиально дифференцированных BMSC образовывать капилляры в полутвердой среде. Клетки двух видов высевали на раствор матричного геля ЭК. Через 12 часов почти 97% клеток были обнаружены в группе BMSCs округлой формы (рис. 6f). Однако дифференцированные эндотелиальные BMSCs обнаруживают видимые трубчатые структуры (Fig. 6g).

Адгезия и пролиферация BMSC на pTa

in vitro

Адгезию и морфологию BMSCs наблюдали с помощью SEM.После 3 дней совместного культивирования мы обнаружили клетки, прикрепленные к поверхности pTa, клеточная морфология показала активный статус и клеточный псевдоподий хорошо распространился (рис. 7a). Наш результат показал превосходную цитосовместимость и адгезию pTa. Мы ожидали, что pTa будет постепенно распространяться.

Рисунок 7.

( a ) Морфология SEM BMSC, прикрепленных к каркасам pTa после 3 дней культивирования (отмечены белыми стрелками; масштабная полоса = 20 мкм).( b ) Анализ CCK-8 показал пролиферацию BMSC после совместного культивирования с pTa в течение 1, 3, 5 и 7 дней. ( c ) Живой анализ гидрогеля ЗНЧ. В день 1 совместного культивирования небольшое количество BMSC прикрепилось к гидрогелю ЗНЧ. ( d ) На 3 день совместного культивирования BMSC адгезированы негомогенно к гидрогелю ЗНЧ, и образовалось несколько клеточных агрегатов. ( e ) Тенденция пролиферации клеток на гидрогеле ЗНЧ была, очевидно, на 5 день совместного культивирования (масштабная полоса = 200 мкм).

Рисунок 7.

( a ) SEM морфология BMSC, прикрепленных к каркасам pTa через 3 дня культивирования (отмечены белыми стрелками; масштабная полоса = 20 мкм). ( b ) Анализ CCK-8 показал пролиферацию BMSC после совместного культивирования с pTa в течение 1, 3, 5 и 7 дней. ( c ) Живой анализ гидрогеля ЗНЧ. В день 1 совместного культивирования небольшое количество BMSC прикрепилось к гидрогелю ЗНЧ. ( d ) На 3 день совместного культивирования BMSC адгезированы негомогенно к гидрогелю ЗНЧ, и образовалось несколько клеточных агрегатов.( e ) Тенденция пролиферации клеток на гидрогеле ЗНЧ была, очевидно, на 5 день совместного культивирования (масштабная полоса = 200 мкм).

Анализировали пролиферацию клеток на рТа. По сравнению с контрольной группой статистические результаты CCK-8 показали, что BMSC совместно культивировали с pTa в течение 1, 3, 5 и 7 дней, пролиферация не подавлялась ( P > 0,05, фиг. 7b). Мы подтвердили, что каркас pTa не обладает цитотоксичностью по отношению к BMSC.

Анализ живых клеток

BMSC засевали на гидрогель ЗНЧ, и анализ живых клеток проводили через 1, 3 и 5 дней.Были отображены нижние поверхности каркасов каждого образца. В день 1 совместного культивирования было небольшое количество BMSC, прикрепленных к гидрогелю ЗНЧ (рис. 7c). На 3-й день совместного культивирования BMSC негомогенно прилипали к гидрогелю ЗНЧ и формировались несколько клеточных агрегатов (рис. 7d). Тенденцию пролиферации клеток на гидрогеле ЗНЧ наблюдали на 5 день совместного культивирования (фиг. 7e).

Гистологический анализ

После 28 дней имплантации отбирали четыре группы подкожных образцов у мышей.Результаты окрашивания по Ван-Гизону показали разницу в степени васкуляризации in vivo (рис. 8a-d). Количественные результаты сосудистых просветов определяли плотность микрососудов, и плотность четырех групп показана на рис. 8e. Парное сравнение различий между группами B, C и D было статистически значимым ( P <0,05). По сравнению с группой A, группа B имела аналогичную плотность микрососудов без значимой разницы ( P > 0,05), тогда как обе группы C и D имели значительно более высокую плотность микрососудов, чем группа A ( P <0.05).

Рисунок 8.

Влияние гидрогелевого каркаса pTa-GNP, связанного с BMSC и происходящими из BMSC ЭК, на ангиогенез. ( a – d ) Окрашивание по Ван Гизону гистологических срезов имплантатов четырех групп через 4 недели после операции показало наличие многочисленных кровеносных сосудов (a: контроль; b: BMSC; c: эндотелиально дифференцированные BMSC; d: эндотелиально дифференцированные. BMSC + BMSC). Белыми стрелками отмечены новообразованные кровеносные сосуды. Большое изображение было увеличено в 100 раз с масштабной полосой = 100 мкм; маленькое изображение было увеличено в 200 раз с масштабной полосой = 100 мкм (отмечено белыми стрелками).( e ) Гистоморфометрический анализ образцов через 28 дней имплантации. Количественные результаты сосудистых просветов определяли плотность микрососудов. Столбцы представляют собой среднюю плотность микрососудов четырех групп имплантатов ± стандартное отклонение. Данные были проанализированы с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) с последующими апостериорными множественными сравнениями с использованием критерия Тьюки. * P <0,05.

Фигура 8.

Влияние гидрогелевого каркаса pTa-GNP, связанного с BMSC и происходящими из BMSC ЭК, на ангиогенез.( a – d ) Окрашивание по Ван Гизону гистологических срезов имплантатов четырех групп через 4 недели после операции показало наличие многочисленных кровеносных сосудов (a: контроль; b: BMSC; c: эндотелиально дифференцированные BMSC; d: эндотелиально дифференцированные. BMSC + BMSC). Белыми стрелками отмечены новообразованные кровеносные сосуды. Большое изображение было увеличено в 100 раз с масштабной полосой = 100 мкм; маленькое изображение было увеличено в 200 раз с масштабной полосой = 100 мкм (отмечено белыми стрелками). ( e ) Гистоморфометрический анализ образцов через 28 дней имплантации.Количественные результаты сосудистых просветов определяли плотность микрососудов. Столбцы представляют собой среднюю плотность микрососудов четырех групп имплантатов ± стандартное отклонение. Данные были проанализированы с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) с последующими апостериорными множественными сравнениями с использованием критерия Тьюки. * P <0,05.

Схема 1.

( a ) Приготовьте схему гидрогеля ЗНЧ. ( b ) Механизм образования коллоидной сети ЗНЧ.

Схема 1.

( a ) Приготовьте схему гидрогеля ЗНЧ. ( b ) Механизм образования коллоидной сети ЗНЧ.

Схема 2.

Схема конструирования васкуляризированных каркасов в подкожной ткани мыши с гидрогелевым каркасом pTa-GNPs в сочетании с BMSC и производными от BMSC EC. BMSC собирали из большеберцовой и бедренной костей мышей. Гидрогелевый каркас PTa-GNPs засевали с BMSCs и происходящими из BMSCs ECs, соответственно. Композитный материал имплантировали в подкожную клетчатку мыши на 4 недели.

Схема 2.

Схема конструирования васкуляризированных каркасов в подкожной ткани мыши с гидрогелевым каркасом pTa-GNPs в сочетании с BMSC и EC, производными от BMSC. BMSC собирали из большеберцовой и бедренной костей мышей. Гидрогелевый каркас PTa-GNPs засевали с BMSCs и происходящими из BMSCs ECs, соответственно. Композитный материал имплантировали в подкожную клетчатку мыши на 4 недели.

Обсуждение

Применение васкуляризации тканей является основной проблемой для клинической трансформации ТЕ.Это исследование было направлено на создание искусственных клеточных каркасов с механической прочностью и соответствующей физиологической микросредой, чтобы имитировать микроструктуру естественной ткани для применения pTa в васкуляризованном TE.

Таким образом, мы разработали 3D гидрогелевый каркас pTa-GNPs, который является биосовместимым с хозяином и демонстрирует биомеханическое поведение. Кроме того, мы исследовали методы эндотелиальной индукции BMSC и 3D совместное культивирование с каркасом. Затем оценивали ангиогенные свойства гидрогелевого каркаса pTa-GNP в сочетании с моделями EC , полученными из BMSC, in vivo .

Технология 3D-печати быстро развивалась в последние годы и широко используется в TE. Он может предложить превосходную гибкость при изготовлении трехмерных образцов сложной геометрии [24]. Поэтому TE постоянно разрабатывает новые материалы для каркасов для улучшения соответствующих механических свойств. Кроме того, в 3D-печати можно напрямую использовать порошок биоматериала для изготовления имплантатов со сложной структурой для замены ткани и достижения желаемого эффекта за счет точного структурного дизайна [25, 26].Благодаря отличной совместимости с тканями, высокой пористости, соответствующему коэффициенту поверхностного трения и низкому модулю упругости, pTa был признан идеальным материалом для ортопедических имплантатов. Более того, с постоянным развитием технологии 3D-печати, pTa имеет широкую область применения [27]. Уотл и др. . использовали технологию SLM для производства высокопрочного pTa с полностью взаимосвязанными открытыми порами, что приблизительно соответствует механическим свойствам человеческой кости, а pTa имеет превосходные остеокондуктивные свойства, нормированную усталостную прочность и высокую пластичность [28].Ван и др. . с целью сравнения с традиционным имплантатом из пористого Ti, образцы Ti и Ta были изготовлены с одинаковой структурой пор с помощью компьютерного проектирования, а затем для изготовления образцов использовался SLM. Было высказано предположение, что pTa оказывает такой же промотирующий эффект на фиксацию кости и равные биологические свойства [29]. В соответствии с нашими предыдущими исследованиями [30], большинство исследований pTa в качестве биоматериала проводилось на совместимости и механической поддержке. Ключевой проблемой для регенерации кости in vivo является сосудистый дефицит инженерной структуры [1].Однако pTa не имеет микроструктуры, имитирующей среду внеклеточного матрикса, и не обладает характеристиками, способствующими васкуляризации. Поэтому мы использовали технологию SLM для производства pTa с определенной структурой и добавили подходящие заполняющие материалы в макропоры pTa для создания подходящей микроструктуры.

Гидрогель с локальной адаптируемостью и долговременной стабильностью объема, обычно образующийся за счет обратимых взаимодействий (таких как электростатические взаимодействия, водородные связи, гидрофильные / гидрофобные взаимодействия и взаимодействия хозяин-гость), стал привлекательным биоматериалом [31].Согласно нашим предыдущим исследованиям [32], гидрогель ЗНЧ демонстрирует сетевой механизм, а самособирающаяся коллоидная сеть может рассеивать биологический стресс. Каркас коллоидных гелей желатина содержит пористую, но взаимосвязанную сеть частиц, диспергированных в водном растворителе. В TE наноструктурированные коллоидные желатиновые гели являются отличными носителями, которые могут способствовать запрограммированному и длительному высвобождению множества белков, а также поддерживать клетки для прикрепления, распространения и пролиферации in vitro .Однако из-за присущих свойств слабых обратимых связей эти адаптируемые гидрогели демонстрируют недостаточную механическую прочность, что ограничивает их широкое применение в качестве биоматериалов in vivo .

Таким образом, мы изготовили новый тип материала трехмерных каркасов в сочетании с гидрогелем pTa и GNPs, чтобы позволить материалу обладать определенной механической прочностью для регенерации клеток и тканей и обеспечить физиологически релевантную микросреду. Мы разработали параметр pTa как 1300 мкм (размер пор), 430 мкм (размер стойки) и 88.6% (пористость) в этом исследовании. Кроме того, механические испытания показали, что прочность на сжатие и модуль упругости составили 8,01 МПа и 1,12 ГПа соответственно. Он может оптимизировать механические свойства и предоставить достаточно места для наполнителей, способствующих формированию и росту сосудов. Между тем, для точного контроля структуры pTa использовалась технология SLM. Реологические характеристики подтвердили, что коллоидный гель ЗНЧ был типичным вязкоупругим гелеобразным материалом. Фантастическая комбинация каркаса pTa и гелей объясняется вязкопластичностью геля.Наблюдалось истончение сдвига и самовосстановление ЗНЧ. Благодаря самовосстановлению коллоидный гель ЗНЧ можно было вводить через иглу шприца. Свойство материала также означает, что он находился в месте имплантации.

Материал каркаса должен поддерживать взаимосвязанную и непрерывную сеть пор, что является критическим фактором для равномерного посева клеток, способствуя транспортировке питательных веществ и удалению отходов и, таким образом, улучшая характеристики васкуляризации материала каркаса [33].Морфология поверхности ЗНЧ и характерные микроструктуры наблюдались с помощью SEM. Он показал пористую структуру с диаметром пор 76 ± 15,3 мкм. Размер пор материала каркаса влияет на адгезию клеток и рост сосудов [34]. Предыдущие исследования показали, что, когда размер пор каркаса превышает 50 мкм, он может обеспечивать диффузию питательных веществ, кислорода и выведение метаболитов, а пористый материал с размером пор 100-200 мкм способствует васкуляризации. [35, 36].Согласно нашим предыдущим исследованиям [20, 37], коллоидный гель ЗНЧ обладал превосходными характеристиками, сочетая механические свойства и способность к самовосстановлению. Более того, он разработан путем тщательного контроля сборки частиц, базового понимания механизма образования и точной настройки структуры и состава гелевой сетки. Органические и неорганические коллоидные строительные блоки состояли из амфотерных мягких ЗНЧ и отрицательно заряженных твердых наночастиц кремнезема, соответственно. Когда чистый заряд GNPs изменяется с отрицательного на положительный, запускается реакция самосборки между противоположно заряженными GNPs и кремнеземом.Хотя дальнодействующие притягивающие электростатические взаимодействия вызывали образование гелевой сетки, последующее образование дополнительных короткодействующих взаимодействий частиц (таких как водородные связи и ван-дер-ваальсовы) превышало отталкивающие электростатические силы, поддерживая целостность гелевой сетки.

Биосовместимость имплантата можно оценить по взаимодействию между имплантатами и BMSC [38]. Адгезию и пролиферацию клеток проводили для оценки взаимодействия материала и BMSC.Взаимодействие оценивали с помощью морфологии клеток SEM, набора CCK-8 и анализа живых клеток. Наши результаты показали, что гидрогели рТа и ЗНЧ обладают превосходной биосовместимостью для клеточной адгезии, жизнеспособности и пролиферации.

Предыдущие исследования показали, что можно создать микрососудистую сеть, используя зрелые ЭК, полученные из сосудистой ткани. Однако клиническое применение ЭК, взятых из аутологичной сосудистой ткани, ограничено из-за отсутствия программы получения достаточного количества клеток [2].МСК имеют большой потенциал в регенеративной медицине и имеют определенную прикладную ценность в сложных ТЭ [14]. Существует множество исследований, в которых сообщается о BMSC для лечения дефектов костей и хрящей, а также поврежденного миокарда после острого инфаркта миокарда [39]. Исследования подтвердили, что BMSC могут дифференцироваться в различные типы соединительных тканей, включая остеоциты, хондроциты и адипоциты, а также могут дифференцироваться в EC и гладкомышечные клетки сосудов [40]. В этом исследовании паттерны экспрессии и способность дифференцировки множественных клонов BMSC оценивались с помощью проточной цитометрии и эксперимента по дифференцировке, соответственно.Более того, результаты показали, что извлеченные нами клетки состояли из идентифицированных BMSC, которые обладают потенциалом множественной дифференцировки. Мы успешно индуцировали BMSC в EC-подобные клетки в индукционной среде. Экспрессию поверхностного маркера ЭК CD31 детектировали проточной цитометрией. Эндотелиально дифференцированные BMSC образуют видимые трубчатые структуры, которые проявляют функциональные свойства ЭК.

BMSC не могут дифференцироваться в кровеносные сосуды спонтанно in vivo ; однако недавние данные показали, что он может дифференцироваться в периваскулярные клетки in vivo , чтобы способствовать ангиогенезу.Следовательно, BMSCs играют роль перицитов в формировании новых кровеносных сосудов и могут стабилизировать и поддерживать развитие сосудистой системы [41]. Более того, существует гетерогенное взаимодействие между BMSC и EC, что обеспечивает преимущества выживания для EC и периваскулярных клеток [42]. Эффективность васкуляризации материала можно эффективно оценить, имплантировав его на спину мышей [43, 44]. В этом исследовании происходящие из BMSC EC и BMSC были засеяны на материалы каркаса для участия в ангиогенезе.Впоследствии мы сравнили свойство ангиогенеза материала каркаса на спине голых мышей. После 28 дней имплантации статистика гистоморфометрии неоваскуляризации с точки зрения плотности показала, что группа C (40 ± 8 сосудов / мм ²) была значительно лучше по сравнению с группой A (20 ± 9 сосудов / мм ²) и B (21 ± 7 сосудов / мм ²). Эти результаты показывают, что во время васкуляризации in vivo ЭК, происходящие из BMSC, оказали значительное влияние, и клетки имеют большой потенциал применения в исследованиях регенеративной медицины.По сравнению с группой C (40 ± 8 сосудов / мм ²), значения группы D (75 ± 6 сосудов / мм ²) предполагают взаимодействие между ЭК, производными от BMSC, и BMSC, которые могут образовывать сосуд в композите. материалы каркаса и совместное культивирование двух типов клеток in vivo может влиять на созревание и стабильность сосудистой сети (фиг. 7). Между тем, группа B (21 ± 7 сосудов / мм ²) была аналогична группе A (20 ± 9 сосудов / мм ²), предполагая, что BMSC играют синергетическую роль в процессе васкуляризации, а не решающую.Кроме того, эти результаты продемонстрировали, что гидрогелевый каркас pTa-GNPs был биологически активным in vivo и способствовал образованию капиллярно-подобной сети in vivo . Из-за недостаточной механической прочности гидрогель ЗНЧ не может сохранять первоначальную форму после подкожной имплантации. Таким образом, группа гидрогеля GNPs не была установлена в этом исследовании.

Основываясь на наших предыдущих исследованиях [23, 45], коллоидный гидрогель имеет некоторую специфическую структуру и характеристики, такие как собственная пористая матрица, большая удельная поверхность желатина, электростатические и гидрофобные взаимодействия с сильным сродством к белкам.Более того, он мог непрерывно высвобождать биомолекулы. В этом исследовании гидрогели ЗНЧ, вероятно, обеспечивали физиологически соответствующую микросреду для регенерации тканей и играли роль абсорбента и пролонгировали высвобождение биологически активных веществ; таким образом, он может индуцировать образование ЭК и ангиогенез. Кроме того, хотя клетки имплантировались случайным образом, анализ живых клеток показал, что BMSC прилипают неоднородно, срезы тканей показали, что вновь образованные кровеносные сосуды были распределены неравномерно.Влияние механической прочности и микропористой структуры ЗНЧ на клеточный иммунитет и миграцию может повлиять на это явление; однако в данном исследовании он не исследовался.

В последнее время стремительно развивается технология 3D биопечати. Среди них были разработаны системы на основе экструзии, системы струйной печати и лазерные технологии для точного распределения клеток в трехмерных структурах [46, 47]. Точное распределение ЭК пупочной вены и гладкомышечных клеток человека с помощью технологии биолазерной печати позволяет контролировать формирование сосудистой сети, а также размер и форму просвета [48].Напротив, при использовании технологии производства струйных термопринтеров раствор тромбина, содержащий ЭК, наносился на матрицу фибриногена для создания трехмерной трубчатой микрососудистой структуры [49]. Вместо использования управляемой компьютером системы осаждения мы случайным образом имплантируем клетки в материал каркаса, чтобы позволить клеткам самоорганизоваться. Однако ЭК, происходящие от BMSC, не были помечены и не отслеживались в этом исследовании. Следовательно, местоположение и количество этих клеток в неоваскуляризации определить невозможно.

Заключение

Таким образом, были разработаны новые интегрированные материалы трехмерных каркасов, обладающие биосовместимостью, биомеханическими и ангиогенными свойствами, а также подход к TE для создания сосудистой инженерной ткани. Мы использовали технологию SLM для производства pTa и заполнили макропоры pTa гидрогелем ЗНЧ. Гидрогель pTa и GNPs не оказывал ингибирующего действия на пролиферацию BMSC in vitro . ECs, происходящие из BMSCs, имплантировали на гидрогелевый каркас pTa-GNPs, и они могли способствовать образованию капиллярно-подобной сети in vivo .Следовательно, эндотелиально дифференцированные BMSCs играют значительную роль в TE. Это исследование могло бы стать основой для применения pTa при регенерации костей; Между тем тканевые сосудистые трансплантаты на основе аутологичных BMSC заслуживают дальнейшего исследования. В развитии костей васкуляризация и минерализация совпадали и могли сделать кость сильно васкуляризованной тканью. Эта работа продемонстрировала возможность реализации васкуляризации кости TE в дальнейших исследованиях.

Финансирование

Работа поддержана Фондом постдокторских наук Китая (No.1), Национальный фонд естественных наук Китая (№ 82172398), Фонд удобства науки и технологий Даляня (№ 2020JJ27SN076), Фонд начала докторских исследований дочерней больницы Чжуншань Даляньского университета (№ DLDXZSYY-BK201809).

Заявление о конфликте интересов . Ничего не объявлено.

Список литературы

Pirosa

Gottardi

Alexander

et al.

Разработка моделей васкуляризированной кости на основе стволовых клеток in vitro для скрининга лекарственных средств и прогнозной токсикологии

Stem Cell Res Ther

2018

;

112

Jain

Tam

et al.

Инженерия васкуляризированных тканей

Nat Biotechnol

2005

;

821

—

Shieh

Vacanti

JP.

Современная тканевая инженерия: от тканевой инженерии до строительства органов

Хирургия

2005

;

137

—

Chrobak

Potter

Tien

Формирование перфузионных функциональных микрососудистых трубок

Microvasc Res

2006

;

185

—

Won

Yun

Jang

et al.

Многофункциональная и стабильная костно-имитирующая белковая матрица для инженерии костной ткани

Биоматериалы

2015

;

—

Seol

Park

et al.

Новый метод изготовления прочных трехмерных керамических каркасов произвольной формы для регенерации костной ткани

Biotechnol Bioeng

2013

;

110

1444

—

Meng

Liu

Синтез тонких пленок тантала и ионная имплантация титана методом плазменной имплантации Депозит

Surf Coat Technol

2013

;

229

205

—

Shen

et al.

Изготовление слоев оксида тантала на титановых подложках для повышения коррозионной стойкости и цитосовместимости

Прибой. Пальто. Технол

2015

;

272

—

млн лет

Cao

и др.

Пористый карбид кремния, покрытый танталом, в качестве потенциального материала для костных имплантатов

Regener Biomater

2020

;

453

—

.10

Мартино

D’Apolito

Sculco

et al.

Тотальное эндопротезирование коленного сустава с использованием бесцементного пористого танталового моноблока большеберцовой кости: минимальный срок наблюдения 10 лет

J. Артропластика

2016

;

2193

—

.11

Hailer

20 лет использования пористого тантала в первичной и ревизионной артропластике тазобедренного сустава — время для критической оценки

Acta Orthop

2018

;

254

—

.12

Скотт

Блэкберн

Эшли

и др.

Достижения в области бионаноматериалов для инженерии костной ткани

J Nanosci Nanotechnol

2013

;

—

,13

Vacanti

Langer

Тканевая инженерия: проектирование и изготовление живых устройств замены для хирургической реконструкции и трансплантации

Ланцет

1999

;

354 Suppl 1

SI32

—

.14

Borlongan

Glover

Tajiri

et al.

Большая миграция стволовых клеток костного мозга к ишемическому мозгу: терапевтическое значение при инсульте и других неврологических расстройствах

Прог Нейробиол

2011

;

213

—

.15

Jiawei

Guojun

Xingquan

et al.

Достижения инъекционных каркасов на основе гидрогеля для регенерации хряща

Regener Biomater

2019

;

129

—

.16

Fercana

Yerneni

Billaud

et al.

Гидрогели периваскулярного внеклеточного матрикса имитируют микроархитектуру нативного матрикса и способствуют ангиогенезу посредством основного фактора роста фибробластов

Биоматериалы

2017

;

123

142

—

,17

Чаудхури

Кламперс

и др.

Гидрогели с настраиваемой релаксацией стресса регулируют судьбу и активность стволовых клеток

Nat Mater

2016

;

326

—

.18

Song

Zheng

Liu

et al.

Натуральный гидрогель на основе комплекса кордицепин / хитозан с выдающимися самовосстанавливающимися и ранозаживляющими свойствами

Int J Biol Macromol

2019

;

134

—

,19

Ван

Леувенбург

и др.

Использование микро- и наносфер в качестве функциональных компонентов для регенерации костной ткани

Tissue Eng Part B Ред.

2012

;

—

.20

Diba

Wang

Kodger

et al.

Высокоэластичные и самовосстанавливающиеся композитные коллоидные гели

Adv Mater

2017

;

1604672.1

—

.21

Zhang

Pei

Zhou

et al.

Биомиметический дизайн и 3D-печать индивидуальных механических свойств пористого каркаса из Ti6Al4V для несущей реконструкции кости

Mater Des

2018

;

152

—

,22

Kaur

Wang

Sun

et al.

Синергетические эффекты отображения поливалентных лигандов и нанотопографии на остеогенную дифференцировку стволовых клеток костного мозга крыс

Биоматериалы

2010

;

5813

—

,23

Ван

Hansen

LoWik

DWPM

и др.

Желатиновые наносферы с противоположным зарядом в качестве строительных блоков для инъекционных и биоразлагаемых гелей

Adv Mater

2011

;

h219

—

.24

Amir

Дизайн для аддитивного биопроизводства: от медицинских устройств для пациентов до рационально разработанных мета-биоматериалов

Int J Mol Sci

2017

;

1607

.25

Задпур

Мальда

Аддитивное производство биоматериалов, тканей и органов

Энн Биомед Энг

2017

;

—

,26

Dadhich

Das

Pal

и др.

Простой подход для 3D-печати остеоиндуктивного многофазного каркаса из фосфата кальция на основе яичной скорлупы

Интерфейсы приложений ACS

2016

;

11910

—

.27

Wei

Cheng

et al.

Коррозионное поведение и характеристики поверхности сплава TiNi, имплантированного танталом

Surf Coat Technol

2008

;

202

3017

—

,28

Wauthle

Johan

VDS

Amin Yavari

et al.

Пористые танталовые имплантаты аддитивного производства

Acta Biomater

2015

;

217

—

,29

Ван

и др.

Сравнение пористых танталовых и титановых каркасов, напечатанных на 3D-принтере, в отношении остеоинтеграции и остеогенеза

Mater Sci Eng

2019

;

104

109908

.30

Wei

Liu

et al.

Пористый тантал, нагруженный мезенхимальными стволовыми клетками, интегрированный с биомиметическим трехмерным каркасом на основе коллагена для восстановления больших костно-хрящевых дефектов у коз

Stem Cell Res Ther

2019

;

.31

Sahoo

VandenBerg

Webber

MJ.

Инъекционные сетевые биоматериалы путем молекулярной или коллоидной самосборки

Adv Drug Deliv Rev

2018

;

127

185

—

207

.32

Wang

Bongio

Farbod

et al.

Разработка инъекционных органических / неорганических коллоидных композитных гелей, состоящих из самособирающихся желатиновых наносфер и нанокристаллов фосфата кальция

Acta Biomater

2014

;

508

—

.33

Xiang-Yu

Gang

Jie

Аддитивные каркасы для инженерии костной ткани и прогноз их механического поведения: обзор

Материалы

2017

;

.34

Карагеоргиу

Каплан

Пористость трехмерных каркасов биоматериала и остеогенез

Биоматериалы

2005

;

5474

—

,35

Park

Jin

et al.

Характеристики каркасов PCL in vitro и in vivo с градиентом размера пор, полученных методом центрифугирования

Биоматериалы

2007

;

1664

—

,36

Акай

Береза

Бохари

MA.

Микроклеточный полимер polyHIPE поддерживает рост остеобластов и формирование кости in vitro

Биоматериалы

2004

;

3991

—

4000

.37

Coradin

Durupthy

Livage

Взаимодействие аминосодержащих пептидов с силикатом натрия и коллоидным кремнеземом: биомиметический подход силификации

Langmuir

2002

;

2331

—

,38

Герреро

Catros

Derkaoui

S-M.

et al.

Клеточные взаимодействия между эндотелиальными клетками, происходящими из предшественников человека, и мезенхимальными стволовыми клетками человека в трехмерном макропористом каркасе на основе полисахаридов способствуют остеогенезу

Acta Biomater

2013

;

8200

—

,39

Джордано

Гальдериси

Марино

IR.

От лабораторного стола к постели пациента: обновленная информация о клинических испытаниях мезенхимальных стволовых клеток

J Cell Physiol

2007

;

211

—

.40

Prockop

DJ.

Стромальные клетки костного мозга как стволовые клетки негематопоэтических тканей

Science

1997

;

276

—

.41

Calderon

Thai

Hsu

et al.

Тубулогенез совместно культивируемых эндотелиальных клеток, полученных из ИПС человека, и мезенхимальных стволовых клеток человека в гелях фибрина и желатинметакрилата

Biomater Sci

2017

;

1652

—

.42

Tam

Fukumura

et al.

Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из костного мозга, способствуют конструированию долговечной функциональной сосудистой сети

Кровь

2008

;

111

4551

—

.43

Melero-Martin

Khan

Picard

et al.

Васкулогенный потенциал in vivo эндотелиальных клеток-предшественников, полученных из крови человека

Кровь

2007

;

109

4761

—

.44

Allen

Kang

Bischoff

Быстрое начало перфузии кровеносных сосудов в ЭК после имплантации коллаген, PuraMatrix и временные матрицы фибрина

J Tissue Eng Regen Med

2015

;

632

—

.45

Wang

Zou

Boerman

et al.

Комбинированная доставка BMP-2 и bFGF из наноструктурированных коллоидных желатиновых гелей и ее влияние на регенерацию костей in vivo

J Control Release

2013

;

166

172

—

.46

Schiele

Corr

Huang

et al.

Методы прямой записи на основе лазера для клеточной печати

Biofabrication

2010

;

032001

.47

Колесский

Truby

Gladman

и др.

Трехмерная биопечать васкуляризированных гетерогенных тканевых конструкций с клетками

Adv Mater

2014

;

3124

—

.48

Barron

Ladouceur

et al.

Биологическая лазерная печать: новая техника для создания гетерогенных трехмерных клеточных узоров

Biomed Microdevices

2004

;

139

—

.49

Cui

Boland

Изготовление микрососудов человека с использованием технологии струйной термопечати

Биоматериалы

2009

;

6221

—

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинал работа правильно процитирована.

Модуляция клеточной активности и поддержание ее специфической функции с помощью электромеханического наногенератора с биоинспирированием

Формирование электромеханических био-NG с биовоздушной реакцией

Недавно в некоторых статьях сообщалось о пьезоэлектрических свойствах полиакрилонитрила (PAN) ( 17 , 18 ).Хотя в целом было установлено, что PAN обычно имеет низкое сегнетоэлектричество, по сравнению с поливинилиденфторидом (современный пьезоэлектрический полимер), PAN имеет меньшие диэлектрические потери и более высокую термическую стабильность и обрабатываемость. В частности, группы ─CN на PAN могут быть гидролизованы в группы ─NH ₂ и группы ─COOH, которые способствуют адгезии клеток и функционализации поверхности. Эта плотная адгезия ячеек была важна для создания пьезоэлектрического эффекта. Следовательно, PAN был чрезвычайно подходящим для электростимуляции in situ в масштабе клетки.Однако узкие микропоры среди плотноупакованных волокон обычно 5 мкм). В этом случае эти каркасы все еще объединяются с клетками в режиме почти 2D роста и не могут обеспечить истинное пространство для роста клеток в 3D. Для решения этой проблемы в раствор электропрядения PAN были введены магнитные наночастицы Fe ₃ O ₄ для изготовления высокодискретных волокон Fe ₃ O ₄ / PAN с использованием устройства для электроспиннинга с магнитной индукцией (рис. 2A и рис. S1). В этом электроспиннинге неодимовый железо-борный магнит мог притягивать наночастицы Fe ₃ O ₄, легированные в волокнах PAN, чтобы преодолевать поверхностное натяжение воды и, таким образом, достигать 3D Fe ₃ O _{4 каркасов} / PAN с хорошо -связанные между собой поры и дискретные волокна для свободной миграции клеток.

Рис. 2. Схематическое изображение и пьезоэлектрический анализ био-НГ.

( A ) Принципиальная схема изготовления высокодискретных пьезоэлектрических волокон Fe ₃ O ₄ / PAN. С помощью неодима-железо-борного магнита Fe ₃ O ₄ магнитных наночастиц были введены в раствор электропрядения ПАН для преодоления поверхностного натяжения воды. ( B ) Проводящий слой PEDOT загружали методом полимеризации in situ; Нанолисты GO адсорбировались на внешнем слое волокон под действием электростатической силы адсорбции, чтобы сформировать целевые волокна GO / PEDOT / Fe ₃ O ₄ / PAN.Изображения одиночного волокна на просвечивающей электронной микроскопии, полученные на каждом этапе. ( C — E ) Оптическое изображение и изображения био-НГ с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). На вставке (D) показано распределение пор по размерам и пористость. На вставке (E) показан диапазон распределения диаметров волокон для волокон GO / PEDOT / Fe ₃ O ₄ / PAN. ( F ) Моделирование методом конечных элементов пьезоэлектрических волокон, соединенных с живой клеткой, генерирующих максимальное напряжение 141 мВ при растяжении под действием тангенциальной силы 10 нН.( G ) Пьезоэлектрический потенциал, создаваемый одним волокном, как функция приложенной тангенциальной силы ячейки. ( H ) Упрощенная цепь резистор-конденсатор, созданная NG, интерфейсом NG-ячейка и клеточной мембраной. ( I ) Пьезоэлектрическая силовая микроскопия (PFM): фазовые и амплитудные изображения PFM одиночного волокна в био-NG. ( J ) Гистерезис фазового электрического потенциала и петли амплитуды «бабочка» волокон в био-NG, полученные при постоянном напряжении от -10 до 10 В.( K ) Напряжение на выходе из био-природного газа при той же силе удара 1 Н (синий) и при вибрации 0,7 Гц (красный). На вставке представлены методы удара (слева) и вибрации (справа), используемые для характеристики волокон в био-НГ. F, сила. Фото: Чуанмей Ши, Нанкинский университет науки и технологий.

В дополнение к трехмерному пространству, среда обитания клеток, более близкая к in vivo, требовала еще одного биофизического сигнала — биоэлектричества. Чтобы улучшить этот биофизический сигнал, на Fe ₃ O ₄ / Волокна PAN посредством процессов самосборки.Введение слоя PEDOT производилось для ускорения межфазного переноса заряда. Полимеризация EDOT на поверхности волокон Fe ₃ O ₄ / PAN происходила в реакционной системе EDOT-FeCl ₃ в безводном диэтиловом эфире; однородный слой PEDOT (~ 2 нм), сформированный под действием ультразвука в бане с ледяной водой (рис. 2B и рис. S2). Примечательно, что поверхность полимеризованного ПЭДОТ в такой реакционной системе обычно была положительно заряженной. Поскольку GO был богат анионными группами, такими как карбоксильные и гидроксильные группы, он мог электростатически адсорбироваться слоем PEDOT и, таким образом, самоорганизовываться во внешний слой GO (~ 30 нм; рис.2Б, рис. S3 и примечание S1), в результате чего целевой каркас состоит из однородных, беспорядочно ориентированных волокон с диаметром от 400 до 900 нм (рис. 2E, вставка). Этот диапазон размеров находился между фибриллами коллагена и их пучками (от 10 нм до 10 мкм; таблица S1). В этом целевом каркасе PEDOT способствовал передаче биоэлектрических и пьезоэлектрических сигналов, а самый внешний слой GO действовал как активные центры для клеточной адгезии. Углеродный скелет в GO может быть π-π конъюгирован с белком, а его полярные группы также могут привлекать гидрофильные функциональные группы клеток.Эти два синергетических эффекта способствовали обмену информацией между клетками. В результате в этом каркасе существовала серия хорошо связанных между собой микропор (пористость 89,38%) со средним размером пор 18 ± 2 мкм (рис. 2, C – E и рис. S4, A – C), таким образом обеспечение того, чтобы клетки могли беспрепятственно мигрировать в каркас с образованием микроокружения трехмерной культуры клеток (таблица S2) ( 19 ). Помимо этих макропор, много микро / мезопор ( 20 ). Наконец, био-НГ с электромеханической связью, собранные этим каркасом, могут создавать локальный поверхностный пьезоэлектрический потенциал за счет присущих клеткам сил, что будет способствовать передаче и передаче сигналов между клетками, имитируя биоэлектрические эффекты коллагеновых фибрилл / волокон в ECM.Пьезоэлектрический потенциал, создаваемый клеточной силой в био-НГ, был смоделирован и изучен с помощью анализа методом конечных элементов. Обычно механические напряжения, создаваемые ячейками, находились в диапазоне наноньютонов (от 0,1 до 10 нН). Два конца пьезоэлектрических волокон были определены как якоря или фиксированные ограничения, и сила нагрузки от 0,1 до 10 нН была приложена к контакту ячейка-волокно. Этих напряжений было достаточно, чтобы изгибать пьезоэлектрические волокна и приводить в движение био-НГ (рис. 2F, рис. S5 и примечание S2). В результате волокна в био-NG давали пьезоэлектрический потенциал, начиная с 14.От 1 мкВ до 1,41 мВ при увеличении силы растяжения клеток с 0,1 до 10 нН (рис. 2G). Этот пьезопотенциал был теоретическим напряжением холостого хода вдоль волокон; однако конечное напряжение, достигающее клеточной мембраны, будет зависеть от проводимости интерфейса NG-клетка (1/ R _int) и электрической модели клеточной мембраны (Рис. 2H и примечание S3). Параллельно с теоретическим пьезоэлектрическим потенциалом, пьезоэлектричество одиночного волокна в био-NG было непосредственно охарактеризовано с помощью пьезоэлектрической силовой микроскопии (PFM; рис.2I). Сильный и высокий фазовый контраст можно было наблюдать от одного волокна, что хорошо согласуется с высоким контрастом на пьезоэлектрическом амплитудном изображении. Это говорит о том, что одиночное волокно в био-NG имеет одиночный пьезоэлектрический домен большой площади вдоль волокна, который был очень предпочтительным для получения высокого пьезоэлектрического отклика под действием сил тяги ячейки. О его сегнетоэлектричестве свидетельствовал гистерезис локального электрического поля и поляризации, полученный с помощью фазовых и амплитудных петель PFM. Как показано на рис.2J, наши целевые волокна демонстрируют четкий гистерезис изменения фазы на 180 ° и гистерезис амплитуды в форме бабочки при переключении приложенного смещения. Кроме того, пьезоэлектрический коэффициент был рассчитан на основе ЧИМ с рассчитанной d ₃₃ амплитудой 4,5 пм / В (примечание S4). Это значение d ₃₃ почти соответствовало заявленному пьезоэлектрическому коэффициенту волокон PAN. В дополнение к демонстрации прямого пьезоэлектрического эффекта, связанного с пьезоэлектрическими волокнами, мы изготовили гибкое испытательное устройство, состоящее из встроенных в полимер пьезоэлектрических волокон, зажатых между верхним медным электродом и проводящей подложкой из полиэтилентерефталата.Сигналы напряжения, генерируемые во время периодических испытаний устройства на ударные нагрузки и колебания, дополнительно подтверждают теоретическую пьезоэлектричество био-NG (рис. 2K).

Физико-химические характеристики био-НГ

Пьезоэлектрическая конформация волокон на основе ПАН в био-НГ была исследована с помощью инфракрасных спектров с преобразованием Фурье (FTIR) и дифракции рентгеновских лучей (XRD). Полосы колебаний при 1250 и 1230 см ⁻¹ были отнесены к зигзагообразной конформации и 3 ¹ -спиральной конформации PAN соответственно (вставка к рис.3A и рис. S6), в котором плоская зигзагообразная конформация играет ключевую роль в пьезоэлектричестве. На основе спектров FTIR содержание зигзагообразной конформации [ f ( z )] было оценено с использованием уравнения. 1 где A ₁₂₃₀ и A ₁₂₅₀ были пиковой интенсивностью на 1230 и 1250 см ^-1, соответственно. Зигзагообразное содержание волокон GO / PEDOT / Fe ₃ O ₄ / PAN составило 59,1%, что сопоставимо с волокнами PEDOT / Fe ₃ O ₄ / PAN (59.3%) и немного выше, чем волокна Fe ₃ O ₄ / PAN (58,6%) (рис. 3C, синий столбчатый). Картины XRD дополнительно подтвердили зигзагообразную конформацию во всех волокнах на основе PAN (рис. 3B, вставка). 2θ больше 17 ° объясняется зигзагообразной конформацией в конформации PAN. Кроме того, Δθ = 2θ — 17 может использоваться для обозначения зигзагообразной конформации ( 18 , 21 ). Как показано на рис. 3C (красный столбец), все 2θ волокон на основе PAN были больше 17 °, что указывает на преобладание зигзагообразной конформации волокон на основе PAN, что хорошо согласуется с результатами FTIR.Опять же, высокое содержание зигзагообразной конформации указывает на высокую пьезоэлектричество волокон в био-NG.

Рис. 3. Характеристики кристалличности и стабильности пространственной структуры пьезоэлектрических волокон на основе ПАН в био-НГ.

( A ) FTIR и ( B ) XRD-спектры Fe ₃ O ₄ / PAN, PEDOT / Fe ₃ O ₄ / PAN и GO / PEDOT / Fe ₃ O ₄ / PAN волокна. а.е., условная единица. ( C ) Содержание зигзагообразной конформации и значения Δθ (2θ — 17) Fe ₃ O ₄ / PAN, PEDOT / Fe ₃ O ₄ / PAN и GO / PEDOT / Fe ₃ O _{4 волокна} / PAN, количественно определено по спектрам FTIR и XRD соответственно.( D ) термограммы ДСК, ( E ) профили циклической вольтамперограммы (CV) и ( F ) угол контакта с водой Fe ₃ O ₄ / PAN, PEDOT / Fe ₃ O ₄ / PAN и GO / PEDOT / Fe ₃ O ₄ / PAN волокна. ( G ) Скорость отскока при сжатии волокон Fe ₃ O ₄ / PAN, PEDOT / Fe ₃ O ₄ / PAN и GO / PEDOT / Fe ₃ O ₄ / PAN при сжатии 5, 7 и 9 мм.( H ) Кривая напряжение-деформация био-НГ при 90% сжатии. ( I ) Распределение среднего размера пор и соотношение среднего размера частиц> 15 мкм. Все планки погрешностей указывают ± SD. Фото: Чуанмей Ши, Нанкинский университет науки и технологий.

Термодинамические свойства пьезоэлектрических волокон на основе PAN в био-NG были проанализированы с помощью термограммы дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). На всех термограммах ДСК появляется слабый экзотермический пик при 110 ° C, который представляет собой тепло, выделяемое кристаллами в ПАН (рис.3D, врезка). Кристалличность ( X _c ) может быть рассчитана по формуле. 2 где X _c — кристалличность образца, ∆ H — энтальпия плавления образца, а ∆ H _f (87,74 Дж / г) — стандартная энтальпия плавления ПАН с полной кристаллизацией. . В результате волокна GO / PEDOT / Fe ₃ O ₄ / PAN дали наивысшее значение X _c , равное 4,77%, тогда как значение X _c для Fe ₃ O _{4 волокна} / PAN были самыми маленькими (3.22%). Это указывает на то, что модификация PEDOT и GO была полезна для улучшения пьезоэлектрических характеристик. Кроме того, в волокнах GO / PEDOT / Fe ₃ O ₄ / PAN температура плавления предварительного окисления PAN сместилась к более высокой температуре с 301,01 ° C до 317,07 ° C, что указывает на то, что введение PEDOT и GO может повысить его термическую стабильность и, следовательно, длительное время удерживают пьезоэлектричество в теле при более высокой температуре, чем температура окружающей среды. Мы дополнительно протестировали свойства накопления и передачи заряда пьезоэлектрических волокон на основе PAN в био-NG с помощью циклической вольтамперограммы (CV) (рис.S2B). Рисунок 3E показал, что все образцы на основе PAN демонстрируют высоко обратимые CV-профили без каких-либо очевидных побочных реакций (пики окисления и восстановления), что свидетельствует о высокой электрохимической стабильности и отсутствии реакции в био-NG. Кроме того, из-за высокой проводимости PEDOT и эффекта псевдоемкости GO, волокна GO / PEDOT / Fe ₃ O ₄ / PAN показали самую высокую зарядную емкость 7,534 × 10 ⁻⁶ ° C. Это будет способствовать передаче пьезоэлектрических зарядов к интерфейсам NG-клетки и, таким образом, способствовать взаимодействию между клетками и, в конечном итоге, модулировать клеточную активность.Кроме того, введение PEDOT и GO привело к изменению каркаса культуры с гидрофобного на гидрофильный, при этом краевой угол смачивания с водой уменьшился с 108 ± 3 ° до 84 ± 2 ° (фиг. 3F и фиг. S3C). Эта гидрофильность почти такая же, как у натуральных коллагеновых волокон ( 22 ), что указывает на то, что разработанные нами био-НГ способствуют клеточной адгезии и пролиферации / росту. Для проверки упругости при сжатии и механических свойств пьезоэлектрических волокон, собранных в био- NG эти волокна были изготовлены в цилиндрической форме диаметром 10 мм и высотой 10 мм (рис.3G, врезка). Мы использовали универсальную испытательную машину для сжатия каркасов, и изученные величины сжатия составили 5 мм (50%), 7,5 мм (75%) и 9 мм (90%) соответственно. Как показано на рис. 3G, волокна обычно демонстрируют отличную упругость. При сжатии на 50% скорость отскока каркасов была близка к 100%. Даже при сжатии на 90% скорость отскока каркасов оставалась> 93,33%; в частности, целевые волокна GO / PEDOT / Fe ₃ O ₄ / PAN достигли 98.44%. С другой стороны, при сжатии 90% модуль сжатия этих волокон, модифицированных GO, заметно увеличился до 117 Па, что почти в три раза больше, чем у волокон Fe ₃ O ₄ / PAN (рис. 3H). Такой превосходный модуль упругости обеспечивает механические свойства, необходимые для культуры клеток мягких тканей (от 0,1 до 3 кПа) ( 23 ). Эти превосходные эластичность и механические свойства гарантируют, что био-НГ, состоящие из волокон GO / PEDOT / Fe ₃ O ₄ / PAN, могут эффективно сохранять свой достаточно большой размер пор (> 15 мкм; рис.3I), обеспечивая тем самым стабильную микросреду трехмерного роста для движения и роста клеток.

Регуляция клеточной активности и поддержание ее функции с помощью био-NG

Взаимодействие NG-клетки в трехмерном пространстве оценивали с использованием двух различных клеточных линий: клеток RGC5 и первичных гепатоцитов. Первые представляли собой потенциалзависимые кальциевые каналы в своих мембранах, тогда как вторые были подвижными клетками с высокими метаболическими функциями. Чтобы полностью оценить возможность трехмерного жизненного пространства клеток и взаимодействия NG-клеток в качестве электростимулятора живых клеток, мы использовали планшет для культивирования тканей (TCP), 2D-NG (примечание S5) и непьезоэлектрический 3D GO / PEDOT / Fe ₃ O ₄ / волокна из полимолочной кислоты (называемые 3D-волокнами; примечание S6) в качестве контрольных субстратов.Среди них TCP в качестве основной контрольной группы использовался для оценки цитосовместимости наших био-NG. 2D NG и непьезоэлектрические 3D волокна использовались для оценки воздействия 3D пространства и электростимуляции на клетки соответственно. Клетки

RGC5 с высокой электрической чувствительностью использовали для оценки потенциальной нейронной индукции био-NG. Сначала был проведен анализ ДНК для оценки пролиферации клеток RGC5 в био-NG. OD ₂₆₀ представляла собой оптическую плотность двухцепочечной ДНК, возбуждаемой лазером с длиной волны 260 нм, которую использовали для подсчета относительного количества клеток.Как показано на фиг. 4A, тесты ДНК показали, что количество RGC5 в био-NG не показало существенной разницы по сравнению с TCP за 5 дней, что свидетельствует о цитосовместимости био-NG. Затем мы всесторонне оценили апоптоз клеток RGC5, культивированных в течение 5 дней. На диаграмме апоптоза (фиг. 4B и фиг. S7) Q1, Q2, Q3 и Q4 представляли мертвые клетки от механического повреждения, нежизнеспособные апоптотические клетки, нормальные клетки и ранние апоптотические клетки, соответственно. Мы обнаружили, что значение Q1 (11,71%) и значение Q4 (23.91%) клеток в био-NG были ниже, чем у TCP (Q1: 13,42%; Q4: 37,1%), что указывает на то, что био-NG не влияли на клеточный цикл. Примечательно, что значение Q2 био-NG (41,16%) было значительно выше, чем значение TCP (25,0%), в то время как значение Q2 (38,61%) 2D-NG, приготовленных из тех же материалов, что и био-NG, было значительно снижено. Клетки с развитым апоптозом в био-НГ в основном были вызваны слишком большим количеством клеток для эффективного обмена метаболитов и питательных веществ с культуральной средой.Это было дополнительно подтверждено значением Q2 (41,28%) 3D-волокон. Эти данные еще раз подтвердили, что био-НГ можно использовать для создания биологически безопасного микроокружения для клеточных культур.

Рис. 4. Рост и развитие нейронов RGC5 в био-НГ.

( A ) Пролиферация нейронов RGC5 с помощью анализа ДНК в дни 1, 3 и 5. ( B ) Апоптоз нейронов RGC5 после 5 дней культивирования в био-NG. ( C ) Рост нейритов из нейронов RGC5 по средней длине нейритов после 5 дней культивирования в био-NG.( D ) 3D конфокальное сканирование нейронов RGC5, культивируемых на TCP, 2D NG и 3D волокнах. ( E ) Трехмерное конфокальное сканирование нейронов RGC5, культивируемых в био-NG, с разных точек зрения. ( F ) Сила клеток, присущая живым клеткам, выращенным в био-НГ. Это вызовет локальное электрическое поле, пропорциональное уровню деформации, которое может в конечном итоге изменить мембранный потенциал и / или конфигурацию мембранных рецепторов, что приведет к открытию каналов Ca ²⁺.Ins3P, трифосфат инозита. PLC, фосфолипаза C. ( G ) Флуоресцентные изображения клеток, предварительно инкубированных с Fluo-4 AM (мембранопроницаемым и зависимым от Ca ²⁺ красителем) на волокнах в био-NG и 3D-волокнах. Зеленый, Ca ²⁺. Все планки погрешностей указывают ± SD.

Затем была оценена адгезия клеток к био-НГ, поскольку это был ключевой параметр для индукции пьезоэлектрического эффекта ( 20 , 24 ). Внутриклеточное напряжение может передаваться через фокальные контакты на нижележащий субстрат ( 25 — 27 ).Следовательно, если ячейка плотно прилегает к поверхности пьезоэлектрических волокон, то любые внутренние силы, создаваемые этой ячейкой, приведут к генерации электрического поля около плазматической мембраны ячейки. Чтобы лучше наблюдать взаимодействие между клетками и био-NG, био-NG и клетки RGC5 окрашивали флуоресцентным агентом родамином B и живым флуоресцентным красителем цитоскелета кальцеином-AM, соответственно. При выполнении трехмерного конфокального сканирования состояние адгезии между NG и клетками можно наблюдать, одновременно возбуждая родамин B (красный) и кальцеин-AM (зеленый).Эти клетки плотно прилипали к волокнам и оборачивались на них в био-NG под разными углами обзора (рис. 4E), но росли только на поверхности 2D-NG (рис. 4D, посередине). Хотя пространственная структура трехмерных волокон (рис. S8) была подобна структуре био-НГ, локальные клеточные агрегаты все еще были распределены в трехмерных волокнах в виде листов [рис. 4D (справа) и рис. S9]. Это может быть связано с тем, что электрический потенциал существует на границе раздела NG-клетки, что способствует образованию множества псевдоподий и, таким образом, лучшему прилипанию к NG.Этот пьезопотенциал, создаваемый био-NGs, ускорял нейраксонизацию клеток, что подтверждается средней длиной нейритов клеток RGC5 (рис. S10). Как показано на фиг. 4C, средняя длина нейритов био-NG была самой длинной, достигая 40 мкм, в то время как средняя длина нейритов 3D волокон составляла всего 18 мкм. Несмотря на это, средняя длина нейритов на 2D NG (31 мкм) была в 1,72 раза больше, чем у 3D волокон. Таким образом, эти результаты предполагают, что электромеханическое взаимодействие с NG может ускорять развитие нейрональных клеток.Наконец, мы проанализировали изменения внутриклеточной концентрации кальция (Ca ²⁺), вызванные взаимодействием клетка-NG. Хорошо известно, что клетки RGC5, подвергнутые воздействию электрического поля, могут претерпевать изменения в их цитозольном Ca ²⁺ ( 3 , 28 ). Ca ²⁺ был вторичным мессенджером, участвующим во множественных путях передачи сигналов. Ca ²⁺ в цитозоле покоящихся клеток было чрезвычайно низким, но когда передача сигналов была активирована, происходит большое увеличение.Несколько факторов могут вызвать увеличение внутриклеточного кальция, например факторы роста ( 29 ) или электрическая стимуляция ( 30 — 32 ). Напряжения, способные локально изменять мембранный потенциал, будут запускать открытие потенциалозависимых кальциевых каналов (рис. 4F), позволяя приток внеклеточного Ca ²⁺, который активирует кальмодулинкиназы. Чтобы проверить это, Ca ²⁺-зависимый краситель Fluo-4 AM был использован для флуоресцентного окрашивания нейронов RGC5 в био-NG и непьезоэлектрических 3D-волокнах, соответственно, в которых интенсивность флуоресценции могла выражать внутриклеточный Ca ²⁺ концентрация до определенной степени.По сравнению с 3D волокнами, клетки био-NG показали более сильную экспрессию Ca ²⁺ (рис. 4G). Эти результаты свидетельствуют о том, что силы клеточной адгезии способны сотрясать или сгибать волокна в био-НГ, вызывая генерацию локального электрического поля, достаточно большого, чтобы стимулировать клетки и изменять их активность. Хорошо известно, что электрический потенциал может стимулировать и регулировать движение подвижных клеток ( 33 , 34 ). Здесь первичные гепатоциты были выбраны в качестве типичных подвижных клеток для оценки взаимодействия био-NG-клетки.Сначала мы использовали световой микроскоп для периодической регистрации подвижности гепатоцитов в час 3, день 1 и день 3. Как показано на фиг. 5A, после 3-часового посева клеток прикрепленные гепатоциты в био-НГ оставались отдельными. В следующее время культивирования гепатоциты в био-НГ начали двигаться вместе и, наконец, образовали сфероидные агрегаты гепатоцитов диаметром ~ 60 мкм. Затем за состоянием гепатоцитов, культивированных в течение 3 дней, дополнительно внимательно наблюдали с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM). Каждый агрегат в био-НГ состоит из нескольких отдельных гепатоцитов (рис.5Б). Большинство гепатоцитов на 3D-волокнах также образовывали сфероидные агрегаты, но их диаметр обычно был меньше 30 мкм (рис. S11B). Что касается 2D NG, некоторые гепатоциты образовывали пластинчатые агрегаты (диаметр от 10 до 60 мкм), но многие гепатоциты не попадали в эти агрегаты (рис. S11C). Подвижность клеток дополнительно оценивали путем подсчета размера и количества агрегатов гепатоцитов. После 3 дней культивирования мы случайным образом выбрали и обследовали 10 участков на каждом образце с помощью инвертированного микроскопа и вручную записали количество агрегатов гепатоцитов (диаметр> 25 мкм) и средний диаметр агрегатов гепатоцитов (рис.5С). Bio-NG и 3D-волокна имели сходное совокупное количество гепатоцитов с диаметром более 25 мкм, что было намного выше, чем у TCP и 2D NG. Это предполагает, что волокна в трехмерном пространстве могут обеспечивать стрессовую поддержку гепатоцитов и вызывать их миграцию с образованием агрегатов. Однако размер агрегатов в био-NG был самым большим — 60 мкм (средний диаметр), что в 2,1 раза больше, чем у 3D-волокон (28 мкм), что указывает на то, что взаимодействие клетки с NG может способствовать миграции гепатоцитов на большие расстояния.Это было дополнительно доказано 2D NG. Хотя на 2D-НГ образовалось меньше агрегатов, средний диаметр агрегатов также достиг 40 мкм. Всесторонне рассматривая количество и размер агрегатов, можно сделать вывод, что взаимодействие электромеханической ячейки и NG в трехмерном пространстве может дополнительно улучшить мобильность ячейки и облегчить перемещение на большие расстояния.

Рис. 5. Подвижность и поддержание функции первичных гепатоцитов в био-НГ.

( A ) Схематическая диаграмма и изображения с помощью светового микроскопа движения гепатоцитов с образованием кластеров клеток.( B ) СЭМ-изображения агрегатов гепатоцитов. ( C ) Размер и количество агрегатов гепатоцитов на 3 день. ( D до F ) Морфология клеток и взаимодействие NG-клеток, включая адгезию клеточной мембраны и очаговый контакт, оцененные с помощью SEM после 15 дней культивирования, показали, что гепатоциты были приклеены к волокнам в био-НГ. ( G ) SEM-изображение, показывающее обмен информацией между агрегатами ячеек. ( H ) Изображения, полученные с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, при обнаружении эпителиального кадгерина (зеленый), показывающие обмен клеточной информацией внутри клеточных агрегатов.( I ) МТТ-анализ не показал признаков токсичности для клеток, культивируемых в био-НГ. Оценка функции печени: ( J ) секреция альбумина (Alb) и ( K ) синтез мочевины в различные моменты времени культивирования. Метаболические функции гепатоцитов: продукция ( L ) 3-циано-7-гидроксикумарина (CHC) и ( M ) 4-метилумбеллиферилглюкуронида (4-MUG) в различные моменты времени культивирования. Все планки погрешностей указывают ± SD. n = 3. * P <0.05 и ** P <0,01.

Затем адгезию клеток к NG после 3-дневного культивирования оценивали с помощью SEM. Мы наблюдали, что мембрана клеток, культивируемых в био-НГ, находилась в тесном контакте с волокнами и что эти клетки испускали короткие и длинные выступы (то есть псевдоподы), прочно прикрепленные к пьезоэлектрическим волокнам в био-НГ (рис. 5, D — F). ). ЕСМ, секретируемый клетками, полностью покрывает волокна, что дополнительно указывает на то, что био-NG прекрасно слились с клетками. Такая тесная адгезия между клетками и NG может заставить NG создавать локальный потенциал на клеточной мембране.Чтобы более четко наблюдать взаимодействие клетки с NG, первичные гепатоциты окрашивали кальцеином (зеленый), флуоресцентным красителем, связанным с плотностью внутриклеточного кальция и кровообращением. Изображение окрашивания кальцеином показало наличие сверхэкспрессированного клеточного матрикса между клетками (ярко-зеленый), как показано на фиг. 5H, что было вызвано слиянием между клетками, что позволяет предположить, что клетки в агрегатах имели обильный обмен информацией. Кроме того, благодаря непрерывной трехмерной волоконной структуре различные агрегаты ячеек также могут обмениваться информацией друг с другом (рис.5G). Эти данные подтвердили, что трехмерное пространство роста и взаимодействие NG-клеток скоординировано для управления миграцией и воссоединением клеток и в конечном итоге формируют широко распространенные кластеры клеток с морфологией клеток, аналогичной естественной ткани печени. Как мы ранее сообщали, агрегация клеток может помочь поддерживать жизнеспособность и функцию печени. экспрессия первичных гепатоцитов ( 35 , 36 ). Сначала проводили анализ 3- (4,5-диметилтиазол-2ил) -2,5-дифенил-2 H -тетразолийбромида (МТТ) для оценки клеточной метаболической активности.Как показано на рис. 5I, тесты МТТ показали, что гепатоциты на каркасах для культур на основе волокон проявляли в целом лучшую клеточную активность, чем гепатоциты на TCP; в частности, гепатоциты в био-NG показали хорошую жизнеспособность клеток даже после 15 дней культивирования. Это произошло потому, что в био-NG существовали широкие клеточные агрегаты, тогда как большинство гепатоцитов на TCP были округлыми, разделенными и имели небольшой межклеточный контакт (рис. S11A). Затем секреция альбумина (Alb) была выбрана в качестве эталона для оценки поддержания функции печени, поскольку продукция Alb была основной синтетической функцией гепатоцитов.Как показано на фиг. 5J, гепатоциты, культивируемые в био-NG, экспрессировали самый высокий уровень секреции Alb. С 1 по 7 день секреция Alb гепатоцитами, культивируемыми в био-НГ, немного снизилась (день 1: 84,7 мкг; день 7: 75,9 мкг), а с 7 по 15 день — быстрое снижение секреции Alb с 75,9 до 45,1 мкг. произошел. Это может быть связано с гибелью свободных гепатоцитов и неизбежным повреждением в процессе выделения клеток. В отличие от био-NG, секреция Alb гепатоцитов, культивируемых в 3D-волокнах, продолжала резко падать с первого дня.Это указывало на то, что выход локального потенциала напряжения NG был благоприятным для функциональной стабильности гепатоцитов. С другой стороны, секреция Alb гепатоцитов, культивируемых в 3D-каркасах, включая био-NG и 3D-волокна, была значительно выше, чем у 2D-каркасов (то есть TCP и 2D NG), что позволяет предположить, что 3D-пространство было важно для функционального поддержания гепатоциты. Аналогичные закономерности были обнаружены также в синтезе мочевины (рис. 5К). Соответственно, трехмерное пространство роста и взаимодействие NG-клеток могут координироваться для поддержания и продления функциональной стабильности гепатоцитов.Цитохром P-450 1A (CYP1A; метаболический фермент I фазы) и ферментативная активность уридиндифосфат-глюкуронилтрансферазы (UGT; метаболический фермент II фазы), стимулированная 3-циано-7-этоксикумарином (CEC) и 4-метилумбеллифероном (4-MU), соответственно, были использованы для оценки метаболических функций гепатоцитов. Гепатоциты, культивированные на 3D-каркасах, показали значительно более высокую скорость превращения ЦИК в 3-циано-7-гидроксикумарин (CHC), чем гепатоциты на 2D-каркасах на протяжении всего периода культивирования (рис.5L), указывая на то, что трехмерное пространство роста клеток может увеличивать ферментативную активность CYP1A. Наибольшая ферментативная активность CYP1A проявлялась на 7-й день из-за образования крупных монослоев клеток и последующего восстановления функции печени гепатоцитами в био-НГ. В отличие от био-NG, самая высокая ферментативная активность CYP1A гепатоцитов, культивируемых в 3D-волокнах, проявлялась в день 1, а затем продолжала снижаться. Эти значения обычно были ниже, чем у био-НГ, что указывает на то, что местный потенциал может способствовать метаболизму I фазы гепатоцитов.Аналогичная тенденция наблюдалась в оценке ферментативной активности UGT (рис. 5M), что свидетельствует о том, что трехмерное пространство роста и взаимодействие NG-клеток также улучшают метаболизм гепатоцитов в фазе II. Кроме того, hMSC были выбраны в качестве еще одной группы клеточных линий для дальнейшего подтверждения. это био-NG-клеточное взаимодействие (рис. S12 и примечание S7). Электростимуляция хорошо известна как эффективный метод для вызова остеогенной дифференцировки стволовых / предшественников клеток и образования костей ( 37 ). Чтобы четко наблюдать морфологию дифференцировки клеток, hMSC флуоресцентно окрашивали диацетатом флуоресцеина (FDA).ЧМСК имели веретенообразную морфологию, особенно на 3D-волокнах и био-НГ. Параллельно с этим hMSC, культивируемые в трехмерных каркасах, включая био-NG и трехмерные волокна, демонстрируют более высокий уровень распространения клеток. Судя по увеличенному изображению флуоресцентных окрашенных изображений FDA, био-NG индуцировали прикрепление клеток с более распространенной морфологией по сравнению с другими каркасами (т.е. TCP, 2D NG и 3D-волокна). Такая уплощенная и многоугольная морфология hMSCs в био-NGs, аналогичная особенностям остеобластов, указывает на раннее начало дифференцировки.Чтобы подтвердить эту дифференцировку остеобластов, была оценена активность щелочной фосфатазы (ЩФ), одного из ранних остеогенных маркеров. Почти в каждый исследуемый момент времени активность ЩФ (ранние остеогенные маркеры) hMSC была значительно выше в био-NG по сравнению с другими каркасами (т.е. TCP, 2D NG и 3D-волокна). Опять же, это дополнительно доказало, что трехмерное пространство, связанное с взаимодействиями NG-клеток, способствует дифференцировке остеобластов. Вместе био-NG-клеточные взаимодействия могут поддерживать и продлевать специфическую функциональную экспрессию, которая, как ожидается, будет применяться в исследованиях клеточной / тканевой инженерии и в потенциальных терапевтических приложениях, таких как биоискусственные устройства для печени, восстановление повреждений нервов, восстановление повреждений печени и т. Д. .

Стимуляция восстановления печени с помощью био-НГ in vivo

В качестве примера демонстрации био-НГ были имплантированы в область повреждения печени (фиг. 6А). Эта область, связанная с регенерацией гепатоцитов, перекликается с вышеупомянутой первичной культурой гепатоцитов in vitro, которая может использоваться для отражения реальной практичности био-НГ. Для клинических исследований на животных в качестве стандартных модельных животных использовали крыс Sprague-Dawley. Мы удалили ткань печени цилиндрической формы диаметром 10 мм и высотой 6 мм из средней части третьей доли печени, что привело к острому повреждению печени.Имплантаты были удалены через 1, 2 и 4 недели имплантации. Анализы воспаления были выполнены путем окрашивания подготовленных слайдов ткани из печени вокруг био-NG гематоксилином и эозином (H&E). Легкое воспаление было обнаружено на первой неделе, которое уменьшилось со второй недели и снизилось до нормального уровня на 4 неделе (рис. 6, B и D). Синхронно были проведены патологические тесты на большинстве жизненно важных органов, включая сердце, легкие, почки и мозг. Окрашивание H&E собирали с этих органов в разные моменты времени (1, 2 и 4 недели) после имплантации.Все органы не показали деформации и аномальной инвазии лимфатических клеток (рис. S13), что дополнительно подтвердило, что все крысы были в хорошем состоянии, а био-НГ не имели системных побочных эффектов. С другой стороны, острое повреждение печени обычно сопровождалось отложением фибрина (огена) в печени, который играл ключевую роль в процессе коагуляции и гемостаза. Крупномасштабное отложение фибрина (огена) произошло в первую неделю, а затем вернулось к нормальному уровню на 4 неделе (рис. 6, C и E). Это указывало на то, что новая система кровообращения (т.е. кровеносный сосуд) образовался внутри регенерированных тканей печени. Примечательно, что по сравнению с био-НГ даже после 4 недель имплантации ткань, регенерированная в 3D-волокна, все еще показывала небольшое воспаление и кровяные барьеры (рис. S14). Такие данные предполагают, что взаимодействия био-NG-клетки могут облегчить воспаление и способствовать восстановлению тканей. Это согласуется с другими опубликованными выводами о том, что электрическая стимуляция может минимизировать воспаление и ускорить ангиогенез ( 38 ).

Рис.6. Стимуляция восстановления печени с помощью био-НГ in vivo.

( A ) Хирургические изображения, показывающие имплантацию био-НГ в дефект печени. ( B ) Окрашивание H&E срезов печени в различные моменты времени (1, 2 и 4 недели) после имплантации. ( C ) Репрезентативные изображения иммуноокрашивания фибрином (оген) печени (зеленый) на 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндоле (DAPI) (синий) срезы печени в имплантированной области. ( D ) Средний процент положительной области, измеренный по окрашиванию H&E.( E ) Количественная оценка иммунофлуоресцентного мечения фибрина печени. ( F ) Иммуноокрашивание на Alb (красный) на срезах печени в разные моменты времени (1, 2 и 4 недели) после имплантации. ( G ) Уровень экспрессии Alb, измеренный с помощью иммуноокрашивания Alb. ( H ) Схема, показывающая три зоны печени от перицентральной до перицентральной области. 1, 2 и 3 обозначают зону 1 (E-CAD ⁺), зону 2 (E-CAD ^─ GS ^─) и зону 3 (GS ⁺) соответственно.Пунктирная стрелка указывает кровоток. ( I и J ) Иммуноокрашивание для GS (зеленый) и E-CAD (красный) на срезах печени на четвертой неделе после имплантации. ( K ) Количественная оценка GS и E-CAD показывает более сильную экспрессию функции печени новых гепатоцитов в био-NG, чем у 3D-волокон. Hep, гепатоцит. Звездочки (*) показывают места имплантации. Данные выражены в виде средних значений ± стандартное отклонение. n = 5. ** P <0,01 и *** P <0.001. Фотография предоставлена: Фей Цзинь, Нанкинский университет науки и технологий.

Затем иммуноокрашивание на Alb использовали для оценки уровня экспрессии функции печени в области регенерации. Как показано на фиг. 6F, интуитивно можно было увидеть, что как плотность клеток регенерации (синий), так и уровень секреции Alb (красный) в био-НГ увеличивались со временем имплантации. Чтобы количественно оценить этот уровень экспрессии, мы извлекли процент области с выражением Alb, как показано на рис. 6G. С 1 по 4 недели уровень секреции Alb значительно увеличился, что указывает на большее образование гепатоцитов в этой области.Напротив, уровень экспрессии Alb в регенерированной ткани в 3D-волокнах был значительно ниже, чем в био-NG (рис. S15), что хорошо согласуется с выводами, полученными из первичной культуры гепатоцитов in vitro. Было высказано предположение, что гепатоциты во всех трех зонах (то есть в перипортальной зоне, центральной зоне и средней зоне) способствовали гомеостазу или возобновлению роста печени после травмы или заболевания ( 39 , 40 ). Чтобы глубоко оценить производительность отрастающей печени, мы дополнительно изучили регенерированные гепатоциты в этих трех различных зонах.Перипортальная зона, окружающая воротную вену, была помечена E-кадгерином (E-CAD), которая была определена как зона 1, в то время как центральная зона, ближайшая к центральной вене, обозначенная как зона 3, была иммуноокрашена глутамин синтетазой (GS). Что касается зоны 2, она состояла из мидзональных гепатоцитов между зонами 1 и 3 (рис. 6H). Было обнаружено, что пролиферирующие перипортальные гепатоциты постепенно устремились к центральной вене, где они в конечном итоге были устранены (рис. 6, I и J), что свидетельствует о хорошем выражении функции печени, что хорошо согласуется с типичной моделью потока гепатоцитов с ее портальными воротами. к центральной направленности ( 41 ).Однако это явление не было обнаружено в 3D-волокнах из группы сравнения (рис. S16). Это указывает на то, что био-НГ эффективно ускоряют восстановление печени. С другой стороны, экспрессия E-CAD была ограничена перипортальными гепатоцитами, тогда как в перивенозных гепатоцитах экспрессировался GS. Следовательно, уровни экспрессии E-CAD и GS также можно использовать для оценки кровеносных сосудов в регенерированной печени, а затем косвенно отражать кровоток внутри. Очевидно, что уровни экспрессии E-CAD и GS в регенерированных тканях в био-НГ были почти на порядок выше, чем у 3D-волокон (рис.6K), что хорошо согласуется с результатами, полученными с помощью иммуноокрашивания на фибрин (оген), которые показали, что био-NG могут ускорять образование кровеносных сосудов. В результате все данные свидетельствуют о том, что взаимодействия био-NG-клетки также применимы in vivo, которые могут координироваться для ускорения восстановления печени и поддержания ее специфической функциональной экспрессии.

IJMS | Бесплатный полнотекстовый | Повышенная васкулогенная способность, вызванная химиорезистентностью к 5-фторурацилу в клеточной линии рака желудка

Рак желудка (GC) на сегодняшний день является шестым злокачественным новообразованием по заболеваемости (5.6%), а четвертый — по смертности (7,7%) во всем мире, за легкими (заболеваемость 11,4%; смертность 18,0%), молочной железой (11,7%; 6,9%), простатой (7,3%; 3,8%), толстой кишкой (10,0%; 9,4%). %), рака печени (4,7%; 8,3%) и немеланомного рака кожи (6,2%; 0,6%) [1]. Даже если более ранняя диагностика и лучшая терапия улучшили общую выживаемость (ОВ), ГК часто диагностируют на поздней стадии, когда опухоль неоперабельна и только химиотерапия может быть полезным подходом [2]. Обычные химиотерапевтические агенты, состоящие из фторпиримидина и препаратов на основе платины, все еще широко используются во всем мире, в то время как иринотекан, ингибитор топоизомеразы I, и таксаны представляют собой более современные методы лечения, которые показали пониженную токсичность [3].Васкуляризация опухоли играет фундаментальную роль в прогрессировании рака и метастазировании, позволяя опухолевым клеткам получать постоянный доступ к кислороду и питательным веществам, избегать иммунного надзора хозяина и сокращать потребление химиотерапевтических агентов [4]. Действительно, во время роста опухоли раковые клетки высвобождают несколько ангиогенных факторов, таких как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактор роста фибробластов-2 (FGF-2), которые нарушают регуляцию гомеостатического равновесия тканей, вызывая деградацию эндотелиальной базальной мембраны из-за к активации матриксных металлопротеиназ (ММП) [5].Повышенная проницаемость сосудов и высокая концентрация проангиогенных факторов приводят к прорастанию и удлинению тканевых эндотелиальных клеток с образованием новых сосудов (ангиогенез), а также к привлечению циркулирующих эндотелиальных клеток (васкулогенез) [6]. Однако неконтролируемое высвобождение ангиогенных факторов и цитокинов часто приводит к образованию протекающих сосудов, типичных для архитектуры опухоли, которые легко используются раковыми клетками для проникновения в кровоток и лимфатический поток и экстравазирования с образованием метастазов в отдаленных местах [7 ].Ангиогенез и васкулогенная мимикрия (VM) являются основными процессами, которые способствуют васкуляризации опухоли, создавая сложную сеть сосудов, состоящую из мозаики эндотелиальных и опухолевых клеток. В то время как ангиогенез обычно описывается как сложный механизм, включающий ремоделирование внеклеточного матрикса, формирование иерархии клеток кончика-стебля и вовлечение перицитов, VM обычно характеризуется лакунами с высокой перфузией крови, не окруженными эндотелием, но состоящими из опухолевых клеток с значительное отложение матричных белков, что часто связано с высокоинвазивными и метастатическими опухолями, что часто сопровождается плохим прогнозом [8].ВМ, который был впервые описан Маниотисом и его коллегами в 1999 г. [9], используется высокопластичными раковыми клетками или индукцией перехода от эпителия к мезенхиме, вызванного неблагоприятными условиями микросреды, такими как гипоксия и кислотность [10]. . Для образования новых кровеносных сосудов описаны два других процесса: сегментация ранее существовавшего кровеносного сосуда за счет вовлечения интерстициальных столбчатых структур, обычно называемого инвагинальным ангиогенезом [11], и кооптация сосуда, часто наблюдаемая. при многих злокачественных новообразованиях, при миграции опухолевых клеток вдоль стенок кровеносного сосуда с образованием новой сложной структуры [12].В предыдущие годы PAS-CD31 считался золотым стандартом для различения ангиогенеза и VM. Совсем недавно был обнаружен альтернативный механизм неоваскуляризации, переход от эпителия к эндотелию (EET), который еще полностью не охарактеризован [13]. EET — это приобретение эндотелиальных маркеров, таких как CD31, VE-Cadherin, Ephrin A2 и др., Эпителиальными раковыми клетками [14]. Было выяснено, что EET индуцируется несколькими факторами микросреды в раковых клетках с высокой пластичностью.В нашем исследовании мы оценили эффекты на клеточном и молекулярном уровне хронического воздействия на линию клеток AGS 5-фторурацила (5-FU), цисплатина (CIS) и паклитаксела (TAX), трех химиотерапевтических агентов, обычно используемых при GC. лечение. Хотя многие механизмы химиорезистентности и родственных мутаций хорошо описаны у азиатских пациентов с ГК [15], мало что известно о механизмах, действующих у людей европеоидной расы, у которых ГК имеет другие особенности и прогноз. Мы стремились изучить механизмы, участвующие в химиорезистентности клеток AGS, уделяя особое внимание способности раковых клеток формировать новую сосудистую сеть.Клетки, устойчивые к 5FU, которые продемонстрировали среди проанализированных фенотипов значительную активацию гена тимидинфосфорилазы (TYMP), были способны образовывать сложные сосуды посредством экспрессии типичных маркеров ангиогенеза.

границ | Комплемент-опсонизированный ВИЧ модулирует пути, вовлеченные в инфицирование тканей слизистой оболочки шейки матки: транскриптомное и протеомное исследование

Введение

Наиболее распространенным способом распространения ВИЧ-1 является гетеросексуальный половой акт, и подавляющее большинство новых инфекций во всем мире происходит у женщин.Иммунобиологические исследования ВИЧ-инфекции, затрагивающей слизистую оболочку шейки матки, имеют первостепенное значение, особенно для лучшего понимания событий, связанных с начальной инфекцией, а также распространения вируса в организме хозяина. Для успешного установления инфекции в организме хозяина вирионы ВИЧ должны пересечь барьер слизистой оболочки половых органов и / или встретиться с определенными иммунными клетками, которые могут переносить вирусы к клеткам-мишеням в эпителии (1, 2). Тканью-мишенью для начальной вирусной инвазии, по-видимому, являются простой столбчатый и многослойный плоский эпителий эндоцервикса и эктоцервикса соответственно (2).Данные свидетельствуют о том, что через 24 часа после воздействия дендритные клетки (ДК) с захваченными вирионами достигают дренирующих лимфатических узлов, где переносят инфекционный ВИЧ в клетки-свидетели (2, 3). Первичными клетками-мишенями ВИЧ и продуктивной вирусной инфекции, по-видимому, являются CD4 + Т-клетки резидентной памяти (TRM) (3).

Барьер слизистой оболочки имеет несколько защитных механизмов для развертывания против различных типов вторгающихся патогенов: слизь как физический барьер и множество антимикробных факторов, которые продуцируются как эпителиальными клетками, так и лейкоцитами для защиты хозяина.Учитывая, что эпителиальные клетки слизистой оболочки представляют собой передний барьер, который ВИЧ должен преодолеть перед установлением инфекции, клетки действительно играют первостепенную роль в приобретении и распространении вируса (4). Кроме того, эпителиальные клетки также продуцируют несколько антимикробных факторов, а также регулируют целостность слизистой оболочки по отношению к молекулам и микробам, которые перемещаются через клеточный слой. Кроме того, они также экспрессируют рецепторы распознавания патогенов (PRR), которые реагируют на патогенную инвазию, инициируя реакцию интерферона типа I и типа III (IFN).Было показано, что такие эпителиальные ответы ограничивают репликацию ВИЧ в макрофагах (4). Кроме того, воздействие ВИЧ также увеличивает производство медиаторов воспаления, таких как TNF, эпителиальными клетками (5). Секретируемые антимикробные факторы включают α- и β-дефенсины, а лизоцимы являются частью защиты слизистой оболочки (6). В дополнение к секретируемым факторам, местная микробиота и основные инфекции, по-видимому, также влияют на защиту слизистой оболочки и предотвращают первоначальное связывание ВИЧ. Воспалительные состояния влагалища, такие как бактериальный вагиноз, связаны с повышенным риском заражения ВИЧ (7, 8).Существующие ранее инфекции, передаваемые половым путем, такие как вирус простого герпеса 2 типа (ВПГ-2), повышают риск заражения ВИЧ из-за рекрутирования большего количества клеток-мишеней в слизистую оболочку половых органов (9). Кроме того, HSV-2 модулирует иммунные клетки слизистой оболочки, делая их более восприимчивыми к ВИЧ-инфекции (10, 11). Наличие провоспалительных цитокинов, продуцируемых во время инфекции и воспаления, особенно TNF, связано с усилением ВИЧ-инфекции (12, 13). Интересно, что уровни IFN типа I могут иметь плеотропные эффекты в зависимости от обстоятельств, и было показано, что они увеличивают как поглощение, так и распространение ВИЧ, а также ограничивают репликацию вируса и защищают от заражения ВИЧ (14).Другие факторы, которые могут влиять на начальную реакцию слизистой оболочки на ВИЧ и другие патогены, включают сперму, которая, как было показано, вызывает воспаление и увеличивает заражение ВИЧ (15). Жидкость, передающая вирус, также содержит факторы, ингибирующие вирусную инфекцию, такие как антитела и несколько типов лектинов (16).

Компартмент женских половых органов содержит множество растворимых факторов, которые участвуют в местной врожденной иммунной защите; примечательными среди них являются белки комплемента, такие как C1q и C3.На начальных этапах инфекции перенесенные вирионы ВИЧ опсонизируются белками комплемента (17), такими как инактивированные C3b (iC3b) и C1q, которые прикрепляются к вирусной поверхности (18). Белок комплемента C3 при активации образует C3b, который может быть частью каскада комплемента, который уничтожает патогены или инфицированные клетки путем цитолиза и вирусолиза. С другой стороны, в случае ВИЧ, C3b превращается в iC3b под действием регуляторных факторов комплемента, обнаруженных в вирусной оболочке и тем самым защищая вирус от вирусолиза (19).Кроме того, C1q прикрепляется к gp120 и gp41, и этот процесс оказывается особенно эффективным в присутствии антител против gp41 (20). На паттерн опсонизации вирионов будет влиять окружающая микросреда и тип ткани или жидкости организма (18) из-за различных уровней антител и факторов комплемента, а также факторов, специфичных для ткани / жидкости. Частицы вируса, которые передаются через слизистую оболочку , должны опсонизироваться комплементом и другими факторами, присутствующими в цервикальном секрете или семенной жидкости, включая ВИЧ-специфические антитела, если донор является серопозитивным к ВИЧ-1 (18).Ранее мы показали, что опсонизация комплемента влияет на ВИЧ-инфекцию, увеличивая захват вируса за счет эмиграции ДК слизистой оболочки шейки матки (21). Кроме того, опсонизация комплемента ВИЧ подавляет воспалительные и противовирусные реакции in vitro, культивируемых в незрелых ДК (22), и влияет на структуру хемотаксических факторов, продуцируемых ДК, что, в свою очередь, изменяет миграцию NK-клеток (23). В этом свете критически важно изучить влияние опсонизации на начальные фазы ВИЧ-инфекции, чтобы лучше понять, какие факторы важны для распространения инфекции.

Слизистая оболочка шейки матки состоит из нескольких слоев различных типов тканей, при этом эндоцервикс выстлан одним слоем столбчатого эпителия, зона трансформации, где столбчатые клетки превращаются в плоскоклеточные клетки, а эктоцервикс выстлан многослойными плоскими эпителиальными клетками. Различные области женского репродуктивного тракта содержат различные подмножества DC и Т-клеток (24–27). ДК играют важную роль в распространении ВИЧ-инфекции у хозяина (25). Подмножества DC обнаруживаются как на базальной мембране, так и во внешних слоях эпителия и представляют собой один из первых типов клеток, которые сталкиваются с ВИЧ в слизистой оболочке шейки матки (28).ДК и миелоидные ДК в слизистой оболочке шейки матки играют важную раннюю роль в захвате ВИЧ и укрывательстве инфекционных вирионов, а также в передаче ВИЧ к CD4 + Т-клеткам (29, 30). На данный момент эпителий также содержит CD1a + DC, которые, как сообщается, сохраняют вирионы ВИЧ и поддерживают их репликацию (31).

эффективны в улавливании, эффективном сохранении и транспортировке вируса через слизистую оболочку для инфицирования Т-клеток в лимфоидных органах (32). CD4 + Т-клетки в шейке матки расположены близко к базальной мембране, но также могут быть обнаружены в многослойном эпителии эктоцервикса, а также в цилиндрическом эпителии эндоцервикса (33).Также стоит отметить, что субпопуляции Т-хелперов (TH) 17 Т-клеток более многочисленны в эктоцервиксе и эндоцервиксе, чем в эндометрии. Кроме того, также сообщалось, что эндоцервикальные CD4 + Т-клетки очень чувствительны к ВИЧ-инфекции in vitro , тогда как клетки того же типа, присутствующие в эндометрии, являются относительно устойчивыми (27). Помимо ДК и Т-клеток, слизистая оболочка шейки матки также содержит макрофаги и миелоидные клетки CD14 +; последний является наиболее распространенным типом иммунных клеток в ткани (33).

Сообщалось, что вирионы-передатчики / основатели ВИЧ являются в первую очередь CCR5-тропными, и что подавляющее большинство новых инфекций вызывается одним единственным передаваемым вирусом-основателем (34, 35). Способность проникать в клетки-мишени приписывается белку оболочки ВИЧ (Env), который включает субъединицы gp120 и gp41, и, в частности, на вирусах-основателях gp120, по-видимому, имеет уникальные фенотипы (16, 36). На начальных этапах ВИЧ-инфекции вирусная популяция заметно однородна.После начальной фазы происходит быстрая эволюция вируса, вероятно, связанная с высоким репликативным потенциалом ВИЧ, что приводит к увеличению генетического разнообразия и, следовательно, к высокогетерогенной популяции ВИЧ у инфицированного человека (16, 34, 35).

ВИЧ-инфекция слизистой оболочки шейки матки ex vivo изучалась несколькими группами, включая нашу (1, 2, 28, 31, 37, 38), но первоначальные иммунные ответы слизистой оболочки шейки матки человека на воздействие ВИЧ не были хорошо охарактеризованы. . Итак, мы попытались изучить влияние свободного или опсонизированного комплементом ВИЧ на начальные события во время передачи вируса, используя модель цервикального эксплантата, чтобы получить представление о факторах, которые облегчают или защищают от передачи вируса, которые могут быть использованы для разработки эффективных защитные вакцины / микробициды.Мы использовали секвенирование РНК и протеомику, чтобы очертить молекулярные события, лежащие в основе различий в экспрессии генов и белков после контакта со свободным и опсонизированным комплементом ВИЧ. Мы обнаружили, что уровни инфицирования ткани слизистой оболочки шейки матки и эмигрирующих иммунных клеток были увеличены после контакта с опсонизированным комплементом ВИЧ и опсонизированным комплементом и антителами ВИЧ по сравнению со свободным ВИЧ. Это увеличение инфекции было отражено в анализах биологической функции и пути заболевания транскриптома и протеома тканей, при этом множественные пути, поддерживающие вирусную инфекцию и репликацию, значительно обогащались / активировались.Сигнальные пути, участвующие в активации иммунной системы, индуцировались через 6 часов после воздействия, но эта активация снижалась через 24 часа после воздействия, как на уровне транскрипта, так и на уровне белка, что указывает на активное подавление иммунитета, индуцированное ВИЧ. Эти ранние события, происходящие в ткани шейки матки, скорее всего, имеют решающее значение для установления вирусной инфекции и ее сохранения.

Материалы и методы

Объекты исследования и одобрение этики

Образцы здоровой ткани шейки матки (N = 41) были получены от лиц, перенесших операцию по пролапсу или гистерэктомию по поводу доброкачественных заболеваний в отделении гинекологии университетской больницы, Линчёпинг, Швеция, после получения информированного согласия до операции.У всех участников были нормальные мазки Папаниколау до операции и не было выявлено клинических признаков патологии шейки матки во время операции. Исследование было одобрено Советом по этике университета Линчёпинга (разрешение по этике EPN M206-06).

Ex vivo Подготовка и культивирование ткани шейки матки

Биопсии ткани шейки матки, собранные у участников исследования, хранили на льду и обрабатывали в течение 30 минут после резекции. Ткани шейки матки были перфорированы на 3 или 8 мм ² биопсии (пункционная биопсия).После этого эпителиальный слой и собственная пластинка были отделены от подлежащей стромы стерильными хирургическими ножницами. Эктоцервикальная и эндоцервикальная биопсии были разделены и помещены в культуральную среду, содержащую RPMI-1640, 20 мкг / мл гентамицина, 10 мМ HEPES (Fisher Scientific, Гетеборг, Швеция), 5% объединенную человеческую сыворотку (Новакеми, Соллентуна, Швеция) и 2,5 мкг. / мл фунгизона (Sigma-Aldrich) таким образом, чтобы эпителиальный слой совпадал с поверхностью раздела жидкости. Затем ткани шейки матки подвергали центрифугированию при дозе 1200 г вместе с BaL ВИЧ-1 (250 нг / мл) в течение 2 часов при 37 ° C.После заражения эксплантаты промывали с помощью RPMI, переносили в 6-луночный планшет, который содержал 1 мл культуральной среды, и оставляли в инкубаторе (37 ° C, 5% CO ₂) на 6 часов до 5 дней перед эксплантатом. и / или эмигрирующие клетки были собраны для дальнейших исследований. Супернатанты культур собирали для анализа цитокинов ELISA / CBA и анализов p24 ВИЧ-1. Графическая иллюстрация того, как выполнялась процедура, представлена на рисунке 1.

Рисунок 1 Модель ВИЧ in vitro, инфекции слизистой оболочки шейки матки.Биопсия шейки матки 3 мм ²-8 мм ² биопсий слизистой оболочки шейки матки центрифугировали 250 нг / мл опсонизированного, известного как свободный ВИЧ-1 (F-HIV), опсонизированного комплементом ВИЧ-1 (C-HIV), ВИЧ-1, опсонизированный комплементом и антителами (CI-HIV), или имитация лечения в течение 2 часов. После этого ткани промывали и повторно инкубировали, а затем собирали через 6, 24 или 5 дней. Ткани слизистой оболочки и эмигрировавшие клетки слизистой оболочки собирали и анализировали с использованием РНК-секвенирования, протеомики, количественной ПЦР и проточной цитометрии.

Производство и опсонизация вируса

HIV-BaL SUPT1-CCR5 CL.30 (Лот № P4238, Лот № 4213, Лот № 4336 и Лот № 4369) Ядро биологических продуктов / Программа по вирусам СПИДа и рака, Национальная лаборатория Фредерика, Фредерик , MD, США, был получен с использованием хронически инфицированных культур линии клеток ACVP / BCP (№ 204), первоначально полученных путем инфицирования клеток SUPT1-CCR5 CL.30 (щедро подаренных доктором Дж. Хокси из Пенсильванского университета) инфекционный запас ВИЧ-1BaL (Программа исследований и референс-реагентов NIH AIDS, Каталожный №416, лот № 59155). Вирус очищали и концентрировали, как описано ранее (39), аликвоты замораживали. Все вирусные препараты проверяли на инфекционность. Кроме того, в нескольких экспериментах использовали вирус-основатель THRO ВИЧ-1 (лот № 4393), продуцируемый в клетках A66-R5 CL.29. Вирус очищали и собирали с помощью центрифугирования в потоке в течение 30 минут, разбавляли до <20% сахарозы, осаждали при 100000 × g в течение 1 часа и замораживали в парах жидкого N2. ВИЧ использовался в различных формах, а именно: свободный ВИЧ (F-HIV, только RPMI), ВИЧ, опсонизированный комплементом (C-HIV), и ВИЧ, опсонизированный комплементом и антителами (CI-HIV).C-HIV был достигнут путем инкубации ВИЧ с 25-50% сывороткой человека от одного донора в течение 1 часа при 37 ° C. CI-HIV был достигнут путем инкубации ВИЧ с 25-50% сывороткой человека от одного донора и смесью неспецифического гамма-глобулина человека 20 мг / мл (Octagam, Стокгольм, Швеция) и 0,2 мг / мл ВИЧ-специфического нейтрализующего IgG (HVIGLOB (40 ), любезный подарок профессора Йормы Хинкулы, Университет Линчёпинга, Швеция) на 1 час при 37 ° C. Проверка протокола опсонизации комплемента была выполнена путем оценки продукции iC3b с помощью ELISA ( Дополнительная фигура 1, ) .

Проточная цитометрия

Эмигрирующие клетки собирали и окрашивали CD3-PE-Cy7 (клон UCHT1), CD4-PE (клон OKT4), CD1a-APC (клон HI149), CD1c-PerCp-Cy5.5 (клон F10 / 21A3) (BD Bioscience, Стокгольм, Швеция), CD163-APC-Cy7 (клон GHI / 61, Nordic Biosite) и Zombie Aqua ™ Fixable Viability Kit (BioLegend). Для внутриклеточного окрашивания ВИЧ-1 клетки промывали, фиксировали с использованием 4% PFA (Fisher Scientific) и пермеабилизировали с использованием 0,2% сапонина и 0,2% FBS в PBS перед инкубацией с любым анти-ВИЧ-1 p24 FITC mAb (KC57, клон Fh290). -1-1, Beckman Coulter) или его соответствующий изотипический контроль (мышь IgG1, Beckman Coulter).Клетки собирали на проточном цитометре BD FACSCanto II, и данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (Treestar, Ashland, OR, США).

Количественный анализ протеомики LC-MS и иммуноанализа мультиплексной протеомики

Соответствующие биопсии эктоцервикальной зоны (n = 5 на одно лечение) подвергали воздействию F-HIV, C-HIV или CI-HIV и культивировали в течение 24 часов. Пятьдесят микрограммов каждого образца расщепляли трипсином в течение ночи, метили изобарическими метками iTRAQ (8-plex) в соответствии с протоколами производителя (AB Sciex), фракционировали с помощью обращенно-фазовой жидкостной хроматографии и прогоняли на масс-спектрометре Velos Orbitrap (Thermo Fisher). с использованием LC-MS / MS, как описано ранее (22, 41).Поиск проводился по базе данных Human SwissProt (2015) с использованием Mascot (Matrix Science). После этого полученные данные анализировали с использованием Scaffold (Proteome Software). Пороги идентификации белков и пептидов были установлены следующим образом: идентификация белка 99%, идентификация пептида 80% и требуется минимум 2 уникальных пептида. Все образцы были нормализованы к эталонному образцу, содержащему смесь всех образцов, включенных в исследование. После этого группы были дополнительно нормализованы по соответствующей необработанной (имитирующей) ткани.Анализ пути и биологической функции выполняли с использованием программного обеспечения Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (Qiagen).

Супернатанты были взяты из цервикальных культур через 96 часов, смешаны 1: 1 с буфером для лизиса RIPA (Sigma Aldrich) и проанализированы с помощью мультиплексного протеомного иммуноанализа Proseek 130 ^® в OLINK Proteomics (Упсала, Швеция), в котором используется приближение близости. пробирная технология (42, 43). Обе панели Immune Response (https://www.olink.com/content/uploads/2017/07/1051-v1.2-Immune-Response-Panel-Content_final.pdf) и панель воспаления (https://www.olink.com/content/uploads/2019/04/1029-v1.3-Inflampting-Panel-Content.pdf) были использованы для анализа, каждый обнаружив 92 уникальных белка.

РНК-последовательность ВИЧ-экспонированной ткани слизистой оболочки шейки матки

Целые ткани шейки матки собирали через 6 и 24 ч после инфицирования, и клетки лизировали с использованием Trizol (Thermofisher, Стокгольм, Швеция) и механического разрушения при 25 Гц в течение 15 минут (Tissuelyser, Qiagen). Лизаты клеток центрифугировали при максимальной скорости в течение 10 мин с последующим смешиванием супернатантов с хлороформом.После дополнительного центрифугирования водную фазу, содержащую РНК, собирали и дополнительно очищали с использованием Isolate II RNA Mini или Micro Kit (Bioline, UK). Количество 5 нг РНК амплифицировали с использованием набора NuGEN Ovation RNA-Seq V2 (Сан-Карлос, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя. Короче говоря, кДНК амплифицировали из общей РНК с использованием процесса изотермической амплификации с одним праймером (SPIA). Позже кДНК очищали с использованием набора MinElute Reaction Cleanup Kit (Qiagen). Образцы кДНК были фрагментированы, закруглены, лигированы с адаптерами со штрих-кодом и еще раз амплифицированы с использованием набора Ultralow System V2 (NuGEN) в соответствии с инструкциями производителя.Окончательное распределение размера библиотеки определяли с использованием Agilent Bioanalyzer 2100. Библиотеки эндоцервикса и эктоцервикса секвенировали на платформе Illumina NextSeq500 (Сан-Диего, Калифорния, США). Качество файлов секвенирования проверялось с помощью программ FastQC и MultiQC, для удаления адаптеров и поиска низкокачественных баз использовался trimmomatic. Затем считывания были сопоставлены с эталонным геномом человека hg19 с использованием STAR. Подсчет экспрессии генов определяли с помощью FeatureCounts. Подсчеты были нормализованы и дополнительно проанализированы для дифференциально экспрессируемых генов с использованием R / DeSeq2.Анализ путей проводился с помощью анализа пути изобретательности (Qiagen), анализа R, анализа обогащения онтологией генов (GO) (Geneontology.org) и через пользовательских списков генов.

RT-qPCR

РНК экстрагировали и очищали, как описано выше. После этого проводили синтез кДНК с использованием набора для синтеза первой цепи кДНК обратной транскриптазы SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). мРНК количественно определяли с использованием набора SensiFAST SYBR ^® Hi-ROX (Bioline, UK) и системы CFX96 Touch Real-Time (BIO-RAD Inc.). Для всех образцов β-актин и GAPDH использовались в качестве генов домашнего хозяйства, и для компенсации вариаций между прогонами ПЦР значения были дополнительно нормализованы, как описано ранее Rieu и Powers (44).

Оценка продуктивной инфекции шейки матки с помощью ВИЧ-1 p24 Gag ELISA и CBA

Для измерения p24 gag ВИЧ-1 супернатанты обрабатывали 0,5% Triton X-100, а количество p24 gag определяли в лаборатории . ELISA для захвата p24 ВИЧ-1 с использованием антител против p24 (любезно подарен проф.Йорма Хинкула). Наборы цитометрических шариков (BD Biosciences) использовали для измерения уровней цитокинов и хемокинов в супернатантах клеточных культур в соответствии с протоколами производителя.

Статистический анализ

GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, Ла-Холла, Калифорния) использовался для стратификации данных и статистического анализа PT-qPCR и ELISA, и группы данных сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA и post Hoc теста Тьюки (a двусторонний парный t-критерий), значение p <0,05 считалось статистически значимым.RNAseq анализировали с помощью DESEQ2, который компенсирует множественные сравнения / повторные измерения). Анализ протеомных данных проводили в R (v3.6.2) с использованием повторного измеренного теста Фридмана. Параметры анализа пути изобретательности: пороговое значение p, равное 0,05, было установлено как существенно затронутые молекулы как для протеомических, так и для транскриптомических данных. Основной анализ IPA использовался для определения того, какие канонические пути, заболевания и биофункции, а также вышестоящие регуляторы были либо повышены, либо понижены с использованием Z-баллов, рассчитанных программой.Сравнительный анализ использовался для сравнения путей, затронутых каждой группой лечения. Тепловые карты использовались для визуализации данных, и в некоторых случаях были выбраны отдельные пути, и молекулы были нанесены отдельно для визуализации включенных молекул.

Результаты

Комплементарная опсонизация ВИЧ увеличивает общую инфекцию слизистой оболочки шейки матки и инфекцию эмигрирующих ДК, но снижает инфицирование эмигрирующих Т-клеток

Цервикальные биопсии подвергались воздействию ложных, F-HIV, C-HIV и CI-HIV и культивируют от 6 часов до 5 дней.Через 24 часа вирусного воздействия мы измерили исходный уровень транскриптов мРНК gag ВИЧ-1 в ткани с помощью q-ПЦР. Опсонизированные комплементом ВИЧ, как C-HIV, так и CI-HIV, индуцировали более высокий уровень транскриптов мРНК gag ВИЧ в ткани слизистой оболочки (фиг. 2A ) . Для оценки инфицирования ВИЧ-1 иммунных клеток слизистой оболочки, которые, как известно, участвуют в начальной инфекции (2), то есть DC (45) и Т-клеток (37), эмигрирующие клетки собирали через 3-5 дней после заражения с последующей проточной цитометрией. исследование для определения количества ВИЧ-инфицированных (p24 gag +) DC (CD1a + или CD1c +) и Т-клеток (CD3 + CD4 +).Здесь показаны ткани шейки матки, инфицированные в течение 4-5 дней ( Рисунок 2B ) . Опсонизация комплемента повлекла за собой более высокую инфекцию эмигрирующих DC, но вызвала более низкую инфекцию эмигрирующих Т-клеток по сравнению с F-HIV ( Рисунок 2B ) . Эти результаты согласуются с тем, что мы показали ранее (21). Уровень p24 gag ВИЧ-1, высвобожденного в супернатант, измеряли на 4-5 день с помощью in-house HIV-1 p24 gag ELISA для оценки общей продуктивной инфекции биоптатов шейки матки.Инфекция явно усиливалась в биопсиях шейки матки, инфицированных C-HIV и CI-HIV, по сравнению с F-HIV (, рис. 2C, ) . Эти данные демонстрируют, что опсонизация представляет собой стратегию, используемую вирусом для создания среды, поддерживающей усиленное инфицирование ткани шейки матки. Затем, чтобы установить влияние воздействия ВИЧ на ткань слизистой оболочки шейки матки и выяснить основные пути и факторы, ответственные за усиление ВИЧ-инфекции, вызванной опсонизацией комплемента, мы выполнили секвенирование РНК, чтобы изучить профили транскриптомов и протеомику LS-MS, чтобы раскрыть профили белков.

Рис. 2 Комплементарная опсонизация ВИЧ увеличивает инфицирование эмигрирующих DC, но снижает инфицирование эмигрирующих Т-клеток. Ткани слизистой оболочки шейки матки подвергали воздействию 250 нг / мл ВИЧ-1 BaL, который был либо F-HIV, C-HIV или CI-HIV, либо имитировал обработку и культивирование в течение 24 часов или 4-5 дней. (A) Ткани слизистой оболочки шейки матки, подвергшиеся воздействию ВИЧ-1, лизировали, очищали РНК и использовали для количественной ПЦР для измерения мРНК ВИЧ1 (gag). (B) Эмигрирующие клетки собирали на 4 или 5 день и клетки окрашивали на анти-CD3, анти-CD4, анти-CD1a / CD1c.Затем клетки, DC (CD1a +) и Т-хелперные клетки (CD3 + CD4 +), окрашивали на gag p24 ВИЧ и анализировали с помощью проточной цитометрии на уровень ВИЧ-инфекции (p24 +). (C) Супернатанты из тканей слизистой оболочки шейки матки, подвергнутых воздействию ВИЧ-1, собирали на 4 или 5 день и анализировали на наличие gag p24 ВИЧ-1 с помощью ELISA (N = 21). * p <0,05, ** p <0,01 и *** p <0,001.

Комплементная опсонизация ВИЧ изменяет антивирусную врожденную иммунную сигнализацию и влияет на ключевые регуляторы воспаления в слизистой оболочке шейки матки

Мы решили изучить начальные транскриптомные ответы, вызванные ВИЧ в эндоцервикальных и эктоцервикальных тканях, подвергнутых воздействию в течение 6 часов, чтобы имитировать, F- ВИЧ, C-HIV или CI-HIV путем секвенирования РНК.Было исследовано влияние на всю ткань шейки матки, то есть на комбинированный транскриптом как эндо-, так и эктоцервикальной ткани (далее именуемую тканью шейки матки). Анализ канонических путей показал, что как C-HIV, так и CI-HIV изменяют сигнальные пути, активируемые ВИЧ в ткани шейки матки, по сравнению с F-HIV (рис. 3A ) . F-HIV активировал большее количество канонических путей, чем C-HIV и CI-HIV, через 6 часов. В ткани слизистой оболочки, подвергшейся воздействию F-HIV, были значительно активированы пути (обозначенные положительными z-значениями), такие как «передача сигналов HMGB1», «роль рецепторов распознавания образов в распознавании бактерий и вирусов», «путь STAT3» и «активация IRF. рецепторами распознавания цитозольных образов ».C-HIV имел положительный Z-балл по передаче сигналов интерферона (, фиг. 3A, ) . Эти пути включают провоспалительные цитокины, такие как HMGB1, CCL2 и CXCL8 (путь передачи сигналов HMBG1), IL6, IRF3, IRF7, CCL5 (роль рецепторов распознавания образов в распознавании пути бактерий и вирусов), интерфероны типа 1 и несколько факторов ответа на интерферон. и гены, стимулированные интерфероном (путь «Активация IRF посредством пути рецепторов распознавания цитозольного паттерна»). Мы использовали количественную ПЦР для подтверждения дисрегуляции экспрессии противовирусных факторов MXA и IFIT3, а провоспалительный фактор IL6 и хемокин CXCL8 были больше повышены в F-HIV по сравнению с C-HIV и CI-HIV через 6 часов в шейке матки и через 24 часа имели IL6 и MX1. ответы исчезли, в то время как ответы CXCL8 и IFIT3 остались (дополнительные рисунки 2A, B).

Рис. 3 Комплементная опсонизация ВИЧ изменяет передачу сигналов врожденного иммунитета и влияет на ключевые регуляторы воспаления в слизистой оболочке шейки матки. Биопсии слизистой оболочки шейки матки (3 мм) центрифугировали 250 нг / мл F-HIV, C-HIV; CI-HIV или имитация в течение 2 часов. Затем биопсии промывали и инкубировали еще 4 или 22 часа. Собирали ткани и эмигрировавшие клетки, очищали РНК и проводили полное секвенирование транскриптома. (A) Канонические пути, полностью затронутые воздействием ВИЧ, i.е. эндо и экто, ткань шейки матки через 6ч. (B) Канонические пути, затронутые воздействием ВИЧ, в экто-цервикальной ткани через 6 часов. (C) Анализ коэффициента логарифмической экспрессии факторов канонического пути «Созревание дендритных клеток», идентифицированных только в ткани эктоцервикса. (D) Анализ логарифмического отношения экспрессии факторов канонического пути «передача сигналов NF-kB», идентифицированных только в ткани эктоцервикса. (E) Канонические пути, затронутые воздействием ВИЧ, в эктоцервикальной ткани только через 24 часа.(N = 6). На тепловых картах показаны пути, на которые значительно повлияла группа лечения (p <0,05), и показаны z-баллы активации.

Канонический путь, называемый «созревание дендритных клеток», был активирован во всех группах со значительно положительным Z-показателем для групп слизистой оболочки, подвергшихся воздействию F-HIV и C-HIV, но не для CI-HIV ( Рисунок 3A ) . При ограничении анализа транскриптомом эктоцервикальной ткани все канонические пути «созревание дендритных клеток», «передача сигналов NF-κB», «передача сигналов CD28 в Т-хелперных клетках» и «передача сигналов IL-2» были положительными для C-ВИЧ. и CI-HIV, с наивысшим Z-баллом в группе C-HIV через 6 часов (рис. 3B ) .Это различие между только эктоцервикальной тканью и цервикальной тканью в отношении пути, такого как «созревание дендритных клеток», может быть связано с тканевым составом с большим количеством эпителиальных клеток в цервикальной ткани и / или составом иммунных клеток и уровнями активации. «Передача сигналов интерферона», «профиль цитокинов», «Созревание дендритных клеток,« Производство оксида азота и активных форм кислорода в макрофагах »,« Передача сигналов IL-6 »,« Роль NFAT в регуляции иммунного ответа »и« ICOS. Передача сигналов ICOSL в Т-хелперных клетках »были некоторыми из репрезентативных групп, которые были активированы среди C-HIV, но не с F-HIV или CI-HIV ( Рисунок 3B ) .Общее влияние на сигнальные пути было выше для тканей слизистой оболочки, подвергшихся воздействию C-HIV, тогда как F-HIV обычно индуцировал отрицательные, то есть ингибирование, Z-баллы, если таковые имелись, для канонических путей. Изучая молекулы, участвующие в некоторых различных канонических путях, наблюдаемых в эктоцервикальных тканях, мы обнаружили, что C-HIV имеет более высокое кратное изменение, чем F- и CI-HIV, почти для всех молекул, относящихся к путям «передачи сигналов NFκB» и « Сигнал о созревании дендритов » ( Рисунки 3C, D ) .Гены, связанные с активацией как DC, так и Т-клеток, были увеличены в эктоцервикальных тканях, подвергшихся воздействию C-HIV и CI-HIV, тогда как ткани, подвергшиеся воздействию F-HIV, оставались неизменными под действием вируса. Большинство эффектов наблюдались после воздействия на ткань C-HIV. Были затронуты такие гены, как LCK, WASP и AKT3, связанные с функциями Т-хелперных клеток (не показаны), а также гены, такие как IL1A, IL23A и LTB (лимфотоксин бета), связанные с сигнализацией созревания дендритных клеток и / или «сигнализацией NFκB». более высоко регулируется в тканях, подвергнутых воздействию C-HIV ( Фигуры 3C, D ) .

Профиль транскриптома был радикально изменен в 24-часовой момент времени по сравнению с первоначальным ответом, наблюдаемым при 6-часовом воздействии

В дополнение к раннему 6-часовому моменту времени мы исследовали профили транскриптома эктоцервикальных тканей после 24 часов контакта с ВИЧ. Анализ канонических путей четко продемонстрировал уменьшение количества активированных генов по сравнению с 6-часовой временной точкой (, рисунки 3A, E ) , что соответствует предыдущим результатам, согласно которым ВИЧ индуцировал временную активацию иммунной системы (22 , 46).Кроме того, канонические пути, задокументированные через 24 часа, отличались от более короткого 6-часового периода воздействия ВИЧ ( Рисунки 3A, E ) . Канонический путь «передача сигналов, опосредованный цАМФ» с такими генами, как AMP, ATP, ERK1 / 2, был значительно увеличен в F-HIV, C-HIV и CI-HIV по сравнению с имитацией. Кроме того, передача сигналов ядерного рецептора была очевидна с «передачей сигналов PPAR» и «активацией LXR / RXR», имеющей положительный значимый Z-показатель во всех группах ВИЧ (фиг. 3E ) . Активация LXR / RXR имела самые высокие положительные Z-баллы для F-HIV, и гены этих путей включают ABCA1, ABCG1, APOA1, APOA4, APOC1, APOE, CCL2, CYP51A1, CYP7A1, HDL, HMGCR, IRF3 и LDL.Опосредованная ретиноевой кислотой передача сигналов апоптоза была обнаружена в F-HIV, но не в C-HIV и CI-HIV (рис. 3E ) . Метаболомные изменения в тканях, индуцированные передачей сигналов LXR / RXR, индуцируются в 24-часовой временной точке, но не уже через 6 часов. Таким образом, через 24 часа профили транскриптома ткани шейки матки демонстрировали повышающую / понижающую регуляцию путей второго мессенджера цАМФ и ядерных рецепторов LXR / RXR, которые, как было известно ранее, участвуют и активируются во время инфекции ВИЧ-1 (47, 48) и уменьшились воспалительные реакции.Было показано, что пути LXR / RXR подавляют ВИЧ-инфекцию (49) и воспалительные реакции (50). Это контрастирует с 6-часовой точкой времени, когда активизировались пути, связанные со созреванием дендритных клеток и передачей сигналов NFκB, что свидетельствует об усилении воспаления в ткани.

Анализ вышестоящих регуляторов показывает динамику транскриптома слизистой оболочки шейки матки после контакта с ВИЧ с временной экспрессией многих генов, которая утрачивается через 24 часа

Профиль транскриптома вышестоящих регуляторов в ткани шейки матки, комбинированный экто и эндоцервикс, через 6 часов после ВИЧ Экспозиция -1 четко показала, что разные формы ВИЧ формируют разные транскриптомные профили.F-HIV показал значительную положительную Z-оценку активации для вышестоящих регуляторов IFNA2, MAP3K7 и CEBPB. В опсонизированных группах ВИЧ значимые положительные Z-баллы активации для IFNL1, FOXA1, AR и TNF были обнаружены в C-HIV, тогда как активация TP53 и EIF2AK2 была предсказана воздействием CI-HIV ( Рисунок 4A ) . В эктоцервиксе влияние TNF в ответ на воздействие C-HIV было даже сильнее, чем наблюдаемое для комбинированного экто и эндоцервикса, что отражалось в том, что большинство молекул, отнесенных IPA к восходящему регуляторному пути TNF, имели более высокие кратные изменения в тканях, подвергшихся воздействию C-HIV, чем в тканях, подвергшихся воздействию F-HIV и CI-HIV ( Фигуры 4B, C ) .Эктоцервикальная ткань, подвергшаяся воздействию C-HIV, также имела положительные Z-баллы, например, для BRD4, цАМФ и NF-κB (комплекс) и значимые P-значения. Между тканями, подвергнутыми воздействию CI-HIV и C-HIV, было большее перекрытие, чем с F-HIV ( Рисунок 4B ) . Опсонизированные группы ВИЧ и общие профили для TNF, BRD4, IL1A, SMARCA4, SSB и IL18. Кроме того, C-HIV также индуцировал активацию PGR, HIF1A, SRA1 и TGFB1 ( Рисунок 4B ) . IL-18 может индуцировать продукцию TNF (51), а кондиционирование TNF, как сообщается, увеличивает экспрессию CCR5 на DC (13, 52).Наши данные свидетельствуют о том, что через 6 часов после контакта с ВИЧ опсонизированные комплементом вирусы вызывали более сильную активацию иммунологической передачи сигналов в ткани шейки матки по сравнению с F-ВИЧ. Через 24 часа после контакта с ВИЧ транскриптомные профили изменились. Воздействие на ткани, вызванное воздействием F-HIV и C-HIV, было отменено, и профили воздействия CI-HIV изменились ( Рисунок 4D ) . CI-HIV выявил положительные Z-баллы для передачи сигналов SPP1, IL1RN, MYD88, CST5, TRIB3 и MAPK1, что позволяет предположить, что антитела, добавленные во время опсонизации комплемента, также влияют на экспрессию генов в ответ на воздействие ВИЧ.Отрицательные Z-баллы вышестоящих регуляторов, таких как цАМФ, IFNγ, TNF и IFNα после контакта с CI-HIV, и отсутствие изменений для F-HIV и C-HIV, предполагают, что все формы ВИЧ либо подавляют передачу сигналов, либо молча лежат в экто-шейке матки. ткань в 24-часовой временной точке ( Рисунок 4D ) . Таким образом, анализ вышестоящих регуляторов показывает, что F-HIV, C-HIV и CI-HIV быстро вызывают различные паттерны экспрессии генов, которые значительно изменяются в течение 24 часов.

Рис. 4 Анализ вышестоящих регуляторов, показывающий активацию и повышающую регуляцию нескольких генов, индуцированных ВИЧ, в ткани слизистой оболочки шейки матки через 6 часов после воздействия, которая теряется через 24 часа.Биопсии слизистой оболочки шейки матки (3 мм) центрифугировали 250 нг / мл F-HIV, C-HIV; CI-HIV или имитация в течение 2 часов. Затем биопсии промывали и инкубировали еще 4 или 22 часа. Ткани собирали, очищали РНК и проводили полное секвенирование транскриптома. (A) Анализ вышестоящих регуляторов, на которые влияет контакт с ВИЧ в целом, т.е. эндо и экто, ткани шейки матки через 6 часов был оценен с помощью IPA и представлен в виде тепловой карты с порогом для значений p, установленным на log ₂ 1.3 представлены как Z-балл активации с пороговым значением Z-балла 0,5. (B) Анализ вышестоящих регуляторов, затронутых воздействием ВИЧ в эктоцервикальной ткани через 6 часов, был оценен IPA и представлен в виде тепловой карты с порогом для значений p, установленным на log 1,3, представленным как Z-балл активации с порогом отсечения 0,2 Z-балла. (C) Анализ вышестоящих регуляторов, на которые влияет воздействие ВИЧ в эктоцервикальной ткани через 24 часа, оценивали с помощью IPA и представляли в виде тепловой карты с порогом для значений p, установленным на log 1.3 представлены как Z-балл активации с пороговым значением Z-балла 0,2. (D) Анализ логарифмического отношения экспрессии факторов, сгруппированных как регуляторы TNF, из фигуры 4b. (N = 6).

Комплемент-опсонизированный ВИЧ активирует пути / группы репликации вирусов в эктоцервикальной ткани

Данные транскриптома РНК seq эктоцервикальной ткани, подвергшейся воздействию ВИЧ-1 в течение 6 часов, были проанализированы в функции IPA «Заболевания и биологические функции» для обогащения. групп / путей, вовлеченных в инфекцию и вирусную репликацию.Мы обнаружили положительные Z-баллы для нескольких путей / групп инфекции и репликации вируса после контакта с опсонизированным комплементом ВИЧ-1, но не после контакта с F-ВИЧ ( Рисунок 5 ) , что ясно демонстрирует, что опсонизация изменила влияние ВИЧ на шейный отдел экспрессия гена слизистой оболочки. C-HIV имел более высокий Z-балл для «вирусной инфекции», «инфицирования клеток», «заражения РНК-вирусами» и «репликации вируса гриппа» (, фиг. 5, ) . Кроме того, пути, названные «заражение ВИЧ-1» и «ВИЧ-инфекция», показали положительные Z-баллы для группы CI-HIV (, фиг. 5, ) .

Фиг. 5 Опсонизированный комплементом ВИЧ активирует инфекции и пути / группы репликации вируса в эктоцервикальной ткани. Биопсии слизистой оболочки шейки матки (3 мм) центрифугировали 250 нг / мл F-HIV, C-HIV; CI-HIV или имитация в течение 2 часов. Затем биопсии промывали и инкубировали еще 4 часа. Ткани собирали, очищали РНК и проводили полное секвенирование транскриптома. Анализ транскриптома seq РНК был проанализирован в IPA с использованием анализа биофункций и заболеваний для обогащения групп / путей, вовлеченных в инфекцию и репликацию вируса, и представлен в виде тепловой карты с порогом для значений p, установленным на log 1.3 (p <0,05) представлены как Z-балл активации. (N = 6).

Воздействие свободного и комплемент-опсонизированного ВИЧ оказывает разнообразное влияние на экспрессию белков, участвующих в канонических путях

Эктоцервикальные биопсии подвергались воздействию ложного, F-HIV, C-HIV или CI-HIV и культивировались в течение 24 часов, после чего они лизировались. и была проведена протеомика LS-MS. Протеомика проводилась только через 24 часа, из-за того, что мы ожидали слабого воздействия на белок через 6 часов. Всего мы идентифицировали 2086 белков, и данные были нормализованы путем вычитания эталона каждого образца (имитация).Во всех образцах было последовательно измерено 1302 белка, и их сравнивали между группами лечения вирусом. Было 40 белков (3,1%), которые были в разном количестве в разных вирусных группах (p <0,05, тест Фридмана) (таблица 1). Однако не было белков, прошедших коррекцию множественной проверки гипотез. После этого все протеомные данные были проанализированы с использованием программного обеспечения IPA для оценки воздействия каждого вирусного лечения на белковые пути и функции. Визуализацию специфической для лечения экспрессии белка проводили с помощью тепловых карт с Z-баллами (, фиг. 6A, ) .Большинство канонических путей подавлялись в группах, получавших ВИЧ, за исключением таких путей, как «передача сигналов RhoGDI», у которых был положительный Z-балл для всех с самым высоким для C-HIV и CI-HIV и системы комплемента, у которого был положительный результат. Z-оценка для F-HIV и C-HIV ( Рисунок 6A ) . Из основных канонических путей, активируемых после лечения F-HIV, наиболее затронутыми были пути передачи сигналов EIF2 и пути, участвующие в передаче сигналов, связанных с Т-клетками, таких как передача сигналов фосфолипазы C, и гормональных сигналов, таких как передача сигналов рецептора эфрина, все с отрицательными Z-баллами, предполагающими ингибирование ( Фигура 6А и Таблица 2 ). C-HIV, с другой стороны, дал отрицательные Z-баллы для нескольких путей, связанных с эндоцитозом, таких как «передача сигналов актинового цитоскелета» и «передача сигналов интегрина» и метаболомная передача сигналов, включая «пути, связанные с RXR». C-HIV также влияет на ремоделирование стыков эпителиальной адгезии ( Рисунок 6A и Таблица 3 ) . CI-HIV повлиял на сигнальные и метаболические пути EIF2, где передача сигналов RXR и PKA была одними из наиболее затронутых путей с отрицательным Z-счетом ( Рисунок 6A и Таблица 4 ) .Сравнение различных групп ВИЧ показало различные модели с некоторой степенью перекрытия ( Рисунок 6B ) . Соответственно, протеомный анализ ткани шейки матки, подвергшейся воздействию различных форм ВИЧ, показал общее ингибирование канонических сигнальных путей для всех видов вирусного лечения. Чтобы установить, сохранился ли этот профиль даже позже в ткани, подвергшейся воздействию ВИЧ-1, мы проанализировали высвободившиеся белки в супернатантах с использованием протеомных панелей Inflamutation и Immune Response через 96 часов.Профили белков через 96 часов показали уменьшение многих белков и, таким образом, подтвердили протеомику GS-MS (дополнительная фигура 3 ).

Таблица 1 Обилие белков в разных группах лечения вирусов разное.

Рис. 6 Воздействие свободного и опсонизированного комплементом ВИЧ оказывает разнообразное влияние на экспрессию белков, участвующих в канонических путях. Экто-цервикальные биопсии обрабатывали F-HIV, C-HIV, CI-HIV или имитировали лечение в течение 24 часов. Образцы лизировали и расщепляли до пептидов, которые метили изобарией iTRAQ и анализировали с помощью ЖХ / МС.Полученные данные затем были нормализованы к ложным образцам, и (A) затронутых канонических путей были проанализированы с помощью IPA и представлены в виде тепловой карты с порогом для значений p, установленным на log 1,3 (p <0,05), и представлены как активация Z -счет. (B) Анализ диаграммы Венна был выполнен для канонических путей, активируемых F-HIV, C-HIV, CI-HIV, для выявления сходства в активации путей. (N = 5).

Таблица 2 Биофункции в ткани слизистой оболочки шейки матки, обработанной F-HIV.

Таблица 3 Биофункции в ткани слизистой оболочки шейки матки, обработанной C-HIV.

Таблица 4 Биофункции в ткани слизистой оболочки шейки матки, обработанной CI-HIV.

Белки, ассоциированные с вирусной инфекцией, активируются в слизистой оболочке шейки матки, подвергающейся воздействию опсонизированного комплементом ВИЧ

При исследовании «Заболеваний и биологических функций» в IPA, было четкое различие в активации путей, связанных с вирусными биофункциями между опсонизированным комплементом вирус и F-HIV (фигура , ) .Обе опсонизированные комплементом формы ВИЧ активируют пути, вовлеченные в вирусную инфекцию, репликацию и инфицирование РНК-вирусами в гораздо большей степени, чем F-ВИЧ. Кроме того, обработка комплементом также индуцировала пути, участвующие в организации цитоплазмы и цитоскелета ( Фиг.7A ) . Углубленное исследование факторов, участвующих в различных путях в «Болезни и биологической функции», было выполнено ( Рисунки 7B – D ). Четкая картина, показывающая более высокое логарифмическое соотношение экспрессии для C-HIV и CI-HIV почти для всех молекул, отнесенных IPA к путям «Вирусная инфекция» и «Инфекция клеток» ( Фигуры 7B, C ) и для нескольких других, вовлеченных в вирусную инфекцию и репликацию, наблюдали высокое перекрытие в молекулах между C- и CI-HIV (данные не показаны).Кроме того, пути «Организация цитоплазмы» и «Организация цитоскелета» показали наивысшее логарифмическое соотношение экспрессии для C-HIV (, фиг. 7D, данные не показаны). В заключение, данные четко указывают на увеличение вирусной инфекции тканей, подвергшихся воздействию C- и CI-HIV, по сравнению с F-HIV, скорее всего, в результате различных сигнальных каскадов, индуцированных в тканях при первоначальном воздействии различных вирусных композиций. .

Рисунок 7 Белки, ассоциированные с вирусной инфекцией, активируются в слизистой оболочке шейки матки, подвергшейся воздействию опсонизированного комплементом ВИЧ.Эктоцервикальные биопсии, обработанные F-HIV, C-HIV, CI-HIV или имитацией, обработанные в течение 24 ч. Образцы лизировали и расщепляли до пептидов, которые метили изобарическими iTRAQ и обрабатывали с помощью ЖХ / МС. Затем полученные данные были нормализованы для имитационных образцов. (A) Затронутые белки были затем проанализированы в функции IPA «Заболевания и биологические функции» для визуализации обогащения групп / путей, вовлеченных в инфекцию и репликацию вируса, и представлены в виде тепловой карты с порогом для значений p, установленным на логарифм. 1.3 (p <0,05) представлены как Z-балл активации. (B) Анализ логарифмического отношения белков факторов, вовлеченных в вирусную инфекцию пути «Заболевания» из фигуры 7A. (C) Анализ логарифмического соотношения белков факторов, участвующих в пути «заболевания». Заражение клеток из фигуры 7A. (D) Анализ логарифмического соотношения белков и факторов, участвующих в пути «Заболевания». Организация цитоплазматических молекул из рисунка 7A. (N = 6).

Обсуждение

Слизистая оболочка шейки матки представляет собой наиболее частый путь передачи ВИЧ, и больше всего новых инфекций происходит у женщин (1, 2).Воздействие первоначального контакта с ВИЧ, то есть в первые 24 часа, на ткань шейки матки не было хорошо изучено и поэтому являлось предметом текущих исследований. С помощью секвенирования РНК и протеомики LS-MS для получения транскриптомного и протеомного профилей, соответственно, были исследованы общие эффекты воздействия ВИЧ на ткань слизистой оболочки шейки матки. Принимая во внимание принятый строгий статистический анализ, полученные результаты приобретают первостепенное значение для улучшения нашего понимания событий на начальных этапах контакта с ВИЧ и установления инфекции.Для начала мы подтвердили, что опсонизированный комплементом ВИЧ представляет более высокий уровень инфицирования ткани шейки матки по сравнению со свободным ВИЧ, а в эмигрирующих клетках предпочтение отдается инфицированию DC, а не CD4 T-клеткам, что согласуется с предыдущими выводами из наша лаборатория (21). Более высокий уровень инфицирования DCs ВИЧ-1 согласуется с данными, полученными нами и несколькими группами для DCs, происходящих из моноцитов (53–56). Наблюдаемое усиление ВИЧ-инфекции эмигрирующих клеток опсонизированным комплементом вирусом было связано со значительной активацией путей и факторов, участвующих в различных аспектах вирусной инфекции, проникновения вируса и репликации вируса, как на транскриптоме, так и на уровни протеома в слизистой оболочке шейки матки и должны отражать эффекты in vivo , поскольку перенесенные вирионы ВИЧ должны быть опсонизированы комплементом (17).Важно отметить, что эффекты, наблюдаемые в тканях на уровне транскриптома и белка, не ограничиваются прямой инфекцией иммунных клеток, но также могут быть отнесены к активации PRR и других врожденных путей в эпителиальных клетках и иммунных клетках, которые подвергаются воздействию но не инфицированы ВИЧ продуктивно, но продуцируют провоспалительные хемокины и противовирусные факторы, как показали другие группы (4, 57, 58). Таким образом, эффекты, наблюдаемые в тканях на уровне транскриптома и белка в этом исследовании, вероятно, связаны с активацией клеток слизистой оболочки, а не ограничиваются прямой инфекцией иммунных клеток.Помимо активации PRR, взаимодействия вирионов с клеткой-мишенью в слизистой оболочке включают множество рецепторов, включая a4b7 для инфекции CD4 T-клеток (59) и Siglec-1 для захвата DC и переноса связанного с клеткой вируса в новые клетки (60). Эта важная ранняя роль DC и миелоидных клеток CD14 + в захвате ВИЧ и укрывательстве инфекционных вирионов, а также в передаче ВИЧ к CD4 + Т-клеткам (29) также может играть важную роль в нашей системе. Помимо роли DC в захвате вирионов в верхнем эпителии, Rhodes et al.показали, что ВИЧ-1 проникает в субэпителиальный слой, где миелоидные клетки, то есть ДК и cDC2, полученные из моноцитов CD14 + CD1c +, становятся инфицированными ВИЧ-1 и передают вирус CD4 + Т-клеткам (30). Интегрированная ДНК ВИЧ была обнаружена на раннем этапе в Т-клетках, но не в миелоидных клетках, что указывает на то, что первоначальная репликация произошла в Т-клетках, а не в миелоидных клетках слизистой оболочки шейки матки (29). Мы обнаружили, что как Т-клетки слизистой оболочки, так и ДК продуктивно заражаются через три дня, и это соответствует результатам нескольких других групп (1, 2, 28, 31, 37, 38).

Существуют различия в составе тканей женских половых путей, то есть между эндоцервиксом и эктоцервиксом, и ясно, что оба эти участка являются мишенями для ВИЧ-инфекции (61). Мы обнаружили инфекцию в эндо- и экто-тканях шейки матки, а также в эмигрирующих ДК и Т-клетках, при этом более высокий уровень инфицирования, вызванный опсонизированным комплементом ВИЧ в ткани и ДК, по сравнению с инфекциями со свободными вирионами, что подтверждает наши предыдущие результаты (21). На иммунный ответ слизистой оболочки шейки матки влияет менструальный цикл (62).Было предложено «окно уязвимости» к ВИЧ-инфекции во время секреторной фазы (63). Большинство доноров тканей в этом исследовании были старше 45 лет, то есть в пременопаузе или менопаузе. Таким образом, в нашей модели мы считаем, что менструальный цикл практически не влияет на инфекционность ВИЧ.

Провоспалительные цитокины и хемокины конститутивно экспрессируются в женских половых путях (64, 65), которые считаются иммунологически активными (65). Это может объяснить, почему на уровне белка наблюдались только ограниченные изменения многих воспалительных факторов в ответ на ВИЧ, несмотря на запуск воспалительных реакций на уровне гена / мРНК.Другим важным аспектом начальных событий как на уровне мРНК, так и на уровне белка на ранних этапах контакта с ВИЧ, является реакция эпителиальных клеток, выстилающих слизистую шейки матки. Было показано, что передача SIV через заражение слизистой оболочки влагалища индуцирует передачу сигналов MIP-3α / CCL20 в эндоцервиксе в сочетании с врожденным иммунным и воспалительным ответами на инфекцию как в шейке матки, так и во влагалище (66). В первоначальном ответе после воздействия SIV эпителий слизистой оболочки шейки матки играл важную роль в производстве воспалительных хемокинов, включая CCL3, CCL20 и CXCL8 (58).Эти хемокины имеют решающее значение для рекрутирования макрофагов, плазмоцитоидных ДК и CD4 + Т-клеток в очаг инфекции, которые преимущественно сгруппированы под эпителием шейки матки в зависимости от хемокинов (58). Кроме того, SIV быстро индуцировал широкий спектр провоспалительных реакций в эпителии слизистой оболочки шейки матки у макак-резус, характеризующихся усилением сигнального пути NF-kB и снижением сигнального пути глюкокортикоидных рецепторов, главным образом в эпителиальных клетках, выстилающих слизистая оболочка (67).В наших данных мы также обнаружили повышенную регуляцию CCL20, CCL2 и CXCL11 после 6 часов контакта с ВИЧ. Кроме того, мы могли измерить увеличение CXCL8 на уровне мРНК, индуцированном F-HIV, и на уровнях белка для всех групп ВИЧ. В 24-часовой момент времени транскрипция этих хемокинов была подавлена. Таким образом, можно предположить, что экспрессия цитокинов, наблюдаемая в модели SIV, может быть вызвана миграцией иммунных клеток в ткань. В соответствии с Shang et al. (67) Передача сигналов NF-kB была активирована на ранней стадии контакта с ВИЧ и установления инфекции.В совокупности эти результаты предполагают, что эпителиальные клетки женских половых путей имеют большое значение в нашей системе, поскольку их модуляция локальной среды слизистой оболочки будет влиять на набор иммунных клеток и установление ВИЧ-инфекции.

Воздействие ВИЧ, как было ранее показано, вызывает временную активацию иммунных ответов на различных моделях (22, 46, 68), что согласуется с нашими настоящими выводами. Начальные события и активация, например, воспалительных реакций в ткани слизистой оболочки через 6 часов после контакта с ВИЧ могут способствовать возникновению инфекции.Сообщалось, что воспаление, даже при низком бессимптомном уровне, может увеличить риск заражения ВИЧ и SIV (66, 69, 70). Транскриптомика показала активацию воспалительных путей в тканях, подвергшихся воздействию опсонизированного комплементом ВИЧ через 6 часов. Обогащение факторов, связанных с воспалительными путями, не отражалось на уровнях белка через 24 часа. Активное подавление трансляции мРНК в белок, вызванное, например, микроРНК, может способствовать отсутствию конгруэнтности (71), а также протеасомной деградации белка через убиквитинирование , путь, который, как известно, используется ВИЧ (72), или пороговое значение значение уровней мРНК для синтеза белка не достигается (73).Ранее было показано, что ВИЧ модулирует процессинг и трансляцию мРНК на нескольких уровнях и перенаправляет синтез белка в сторону более благоприятного состояния для репликации и распространения вируса (68).

В комбинированных эндо- и экто-цервикальных тканях анализ путей показал активацию пути передачи сигналов IFN с помощью IFNA и IFNL1 в качестве верхних обогащенных вышестоящих регуляторов после 6-часового воздействия. Обогащение факторов, связанных с IFNA и IFNL1, было более выражено в тканях, подвергшихся воздействию F-HIV, чем C- / CI-HIV в этот момент времени.Это соответствует предыдущим результатам, в которых мы показали опосредованное CR3 подавление противовирусных путей в ДК, подвергшихся воздействию опсонизированного комплементом ВИЧ (22).

Метаболические изменения были изучены во многих аспектах воспаления и инфекции, но не в тканях шейки матки в контексте ВИЧ-инфекции. После контакта с ВИЧ в 24-часовой временной точке наблюдалось обогащение факторов путей PPAR и LXR / RXR. И транскриптомика, и протеомика указывают на активацию сигнальных путей LXR / RXR.Иммунные клетки в состоянии покоя и памяти в основном метаболически неактивны, но после стимуляции могут перестроить свой метаболизм в сторону более быстрого производства АТФ и важных строительных блоков для индукции сильного иммунного ответа (74). LXR образуют гетеродимеры с RXR, и этот комплекс действует как модулятор гомеостаза липидов и холестерина, а также воспалительной передачи сигналов (75). Передача сигналов LXR связана с подавлением воспаления за счет ингибирования NF-κB (50). Следовательно, активация этих путей указывает на активное подавление воспалительной передачи сигналов в тканях, подвергшихся воздействию ВИЧ.Транскриптомные данные также предполагают ингибирование воспаления после 24 часов контакта с ВИЧ, поскольку были отрицательные Z-баллы, т. Е. Ингибирование / подавление «передачи сигналов Toll-подобного рецептора» и «Роль рецепторов распознавания патогенов в распознавании бактерий и вирусов» при этот момент времени. Передача противовоспалительного сигнала через 24 часа была наиболее выраженной после контакта с опсонизированным комплементом ВИЧ. Сигнальный путь протеинкиназы A (PKA) (47, 76, 77) был активирован для C-HIV и CI-HIV. PKA вместе с передачей сигналов цАМФ является важным модулятором многих различных путей, участвующих в активации иммунной системы, и ингибирует транскрипцию нескольких воспалительных цитокинов, индуцированных путем NF-κB (77).Кроме того, ранее было показано, что у ВИЧ-инфицированных повышается уровень цАМФ (76, 77). Вместе эти данные предполагают подавление воспалительной реакции ткани шейки матки и, возможно, сдвиг в сторону иммуносупрессивной среды в ткани, предпочтительно индуцированной опсонизированным ВИЧ через 24 часа после контакта.

ВИЧ, опсонизированный сывороткой и содержащими сыворотку ВИЧ-специфическими антителами, усиливает интернализацию вирионов посредством опосредованного рецептором эндоцитоза (56, 78) и рецепторов, участвующих в вирусном взаимодействии и захвате.Рецепторы, участвующие в эндоцитозе, включают рецепторы комплемента и Fc-рецепторы. Повышенные уровни белков, участвующих в эндоцитозе после контакта с C-HIV в эксплантатах ткани шейки матки, могут коррелировать с повышенным захватом вируса и увеличением распространения вируса. Ранее мы показали, что связывание C-HIV и передача сигнала через рецептор 3 комплемента индуцируют подавление противовирусного и воспалительного ответа в незрелых DC через взаимодействие рецептора 3 комплемента (22).В основном это было связано с фиксацией молекул iC3b на вирусной поверхности во время опсонизации ВИЧ (19). Было показано, что эффекты комплемента ВИЧ-1 на ДК зависят от баланса CR3 и CR4 на ДК, при этом высокий уровень CR3 приводит к подавлению воспаления и противовирусной активности, тогда как высокий уровень CR4 вызывает и активацию (79). . Присутствие ранее существовавших ВИЧ-специфических антител, таких как анти-gp120 и анти-gp41, во время опсонизации комплемента увеличивает отложение C1q на поверхности вируса (20).Активация Fc-рецепторов опсонизированными комплементом вирионами также влияет на последующий ответ (80). Например, было показано, что активация FcγRIIB, индуцированная образованием специфичных для SIV иммунных комплексов после вакцинации против SIV макак-резус, вызывает подавление иммунитета в эпителии слизистой оболочки (67). Модуляция передачи сигналов Fc-рецептора также могла повлиять на настоящие результаты, поскольку эти рецепторы могут преобразовывать широкий спектр различных иммунологических и специфичных для ВИЧ эффекторных функций (80).Различия в путях, активируемых C-HIV и CI-HIV, можно объяснить различиями в вовлечении Fc-рецептора. Кроме того, различия в экспрессии микро-РНК между тканями, подвергнутыми воздействию C-HIV и CI-HIV, могут вносить вклад в различия в воспалительной передаче сигналов путем модуляции передачи сигналов, индуцированной Fc-рецептором.

В дополнение к рецептор-опосредованному подавлению иммунитета, может также существовать регуляция трансляции мРНК в белок через miRNA. Нарушение регуляции miRNA было показано во время ВИЧ-инфекции, а также вовлечено в нарушения целостности желудочно-кишечного тракта, обнаруживаемые у ВИЧ-инфицированных (81).Тем не менее, мы не обнаружили, что они затронуты в нашей системе, и для miRNAs со значительным кратным изменением в нашей системе функции остаются неизвестными. Потенциально они могут быть вовлечены в ограниченное воспаление и противовирусные реакции, а также в усиление ВИЧ-инфекции, учитывая их важную роль в регулировании ответов, наблюдаемую в тканях, подвергшихся воздействию опсонизированного комплементом ВИЧ, и, следовательно, требует дальнейшего изучения.

Одним из ограничений исследования является использование спинокуляции для инфицирования ткани слизистой оболочки (37), поскольку этот метод позволяет вирионам получить доступ к ткани не только с апикальной / эпителиальной стороны.Рациональность использования этого метода заключалась в том, что он позволяет достичь более высокого уровня инфицирования ВИЧ-1 по сравнению с другими методами заражения.

В заключение, мы наблюдали усиление ВИЧ-инфекции в ткани шейки матки, когда вирионы были опсонизированы комплементом и / или иммуноглобулинами. Анализ пути экспрессии генов ткани шейки матки показал обогащение факторов, связанных с активацией различных иммуномодулирующих и воспалительных путей, которые зависели от времени. Протеомика показала, что большинство генов иммунного пути, активированных на уровне транскрипции, не транслируются в белки.Мы нашли доказательства активного подавления иммунных ответов, что создает благоприятную среду для ВИЧ-инфекции. Опсонизация комплемента имеет решающее значение на ранних этапах передачи ВИЧ-инфекции половым путем. Эффекты, оказываемые опсонизированными комплементом вирионами, следует учитывать при разработке лекарств и стратегий предотвращения передачи ВИЧ.

Заявление о доступности данных

Данные, представленные в исследовании, депонированы в репозитории NCBI GEO, инвентарный номер GSE160774.

Заявление об этике

Исследование было одобрено Советом по этике университета Линчёпинга (разрешение по этике EPN M206-06). Письменное информированное согласие на участие не требовалось для этого исследования в соответствии с национальным законодательством и институциональными требованиями.

Вклад авторов

CS, RE, MK, EC, MS, SN, ML, ES, KB и AB провели эксперимент и / или проанализировали данные. NB предоставила образцы ткани шейки матки человека. Рукопись написали CS, RE, SN, ES и ML.NB, KB, EC, MK и AB редактировали рукопись. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

Эта работа была частично поддержана за счет федеральных средств Национального института рака, Национальных институтов здравоохранения по контракту № HHSN261200800001E.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Выражение признательности

Мы хотели бы поблагодарить Джулиана В. Бесса-младшего и Центр биологических продуктов Программы по борьбе с вирусами СПИДа и рака, Национальная лаборатория Фредерика, Фредерик, Мэриленд, США, за предоставление вируса HIV-BaL SUPT1-CCR5 CL.30 использованный в этих исследованиях. Эта работа была поддержана: Шведским исследовательским советом, Фондом исследований шведских врачей против СПИДа, Исследовательским фондом университетской больницы Линчёпинга, Forsknings ALF и Шведским медицинским обществом по ML. Вычисления для RNAseq были выполнены на ресурсах, предоставленных SNIC через Уппсальский многопрофильный центр передовых вычислительных наук (UPPMAX) в рамках проекта b2015293.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2021.625649/full#supplementary-material

Ссылки

3. Cantero- Перес Дж., Грау-Экспозито Дж., Серра-Пейнадо С., Росеро Д.А., Луке-Баллестерос Л., Асторга-Гамаза А. и др. Резидентные Т-клетки памяти являются клеточным резервуаром ВИЧ в слизистой оболочке шейки матки. Нац Коммуна (2019) 10 (1): 4739. doi: 10.1038 / s41467-019-12732-2